The PCR-DGGE analysis of bulk cells

The PCR-DGGE analysis of bulk cells after cultivation can also support the analysis of the
microbial diversity in food after direct DNA extraction. It can be useful to understand which species found in the DGGE profiles are cultivable and whether there is agreement or inconsistency between the results obtained by PCR-DGGE from direct DNA extraction and species detection after cultivation. For example, comparing DGGE profiles of mineral waters and fingerprints of the plated samples of the same waters, Dewettinck et al. (2001) established the percentage of noncultivable species in their bottled mineral water samples. Ro¨ling et al. (2001) used this approach to investigate the dynamics of the cultivable community during the manufacturing of vanilla beans from different batches. The authors could relate the number of bacteria counted on media to the diversity in number of species dominating every specific phase of the process. Moreover, the analysis of the bulk DGGE profiles allowed to observe the shifts of the cultivable community members following temperature treatments and to highlight the presence of unculturable species by comparing the same profiles with the DGGE fingerprints of the DNA directly extracted from the samples (Ro¨ling et al., 2001). Similarly, Ercolini et al.
(2003a) realised that the Lactococcus species used as starter in Stilton cheese could not be isolated from the final product. In fact, the species was recovered as DGGE band in the Stilton profile but not from the bulk profile from the countable plates. Furthermore, Ercolini et al. (2001b) enlarged the number of species identified in NWCs for Mozzarella cheese production by sequencing DGGE bands from bulk profiles arising from specific media; this result may indicate that sometimes retrieving information on the microbial diversity only from DGGE profiles after a direct DNA extraction from a food sample cannot be enough, and that cultivation should be also considered. Analysis of DGGE profiles obtained from bulk cells provides an image of the cultivable community, while simultaneously allowing ecological information to be obtained. Ercolini et al. (2001b) counted in NWCs for Mozzarella cheese production a population of mesophilic streptococci of 108 cfu ml
1, but realised, after the bulk PCR-DGGE analysis of all the dilutions, that the only species reaching the value of 108 was the thermophilic S. thermophilus and that mesophilic cocci were only present at levels of 104 cfu ml
1. A novel application of this approach has been recently reported by Miambi et al. (2003). The PCRDGGE analysis was performed on DNA extracted from enriched cultures in appropriate liquid media used for most probable number (MPN) counts of samples of cassava dough. The analysis allowed to identify the dominant species occurring at the highest dilutions; moreover, it was possible to identify species that did not occur in the DGGE profiles arising from DNA directly extracted from the cassava samples. Miambi et al. (2003) could also evaluate the suitability of the culture media employed and concluded that none of the substrates could cover all the representative members of the bacterial community and that a series of selective media should be employed to count and isolate bacteria during cassava fermentation. This procedure can also
investigate on the selectivity of some culture media. In some cases, in fact, it was shown that the selectivity of some culture media for LAB was not satisfactory (Ercolini et al., 2001b, 2003a).
7. Reference patterns: markers ‘‘made of species’’
An alternative to the sequencing of the DGGE bands to identify the microbial species occurring in a DGGE profile is constructing a molecular ladder using 16S rDNA amplicons of representative species of the food to analyse. The PCR product from the DNA template directly extracted from the food is run in a DGGE gel along with a mixture of the amplicons of the reference species as ladder. The identification of bacteria is then achieved by comparison of the PCR amplicon migration distances in DGGE gels with those of reference strains present in the identification
ladder. Although this procedure is much easier than the sequencing of the bands, it does not absolutely guarantee an unequivocal identification due to some implicit drawbacks. Several authors report cases of comigration of amplicons from different species in the DGGE gel (Ercolini et al., 2001a, 2003a; van Beek and Priest, 2002; Meroth et al., 2003). This is because
many species of bacteria are closely related and the 16S rDNA fragment analysed may not contain major differences allowing separation by DGGE.

Kết quả (Việt) 2:

Các phân tích PCR-DGGE của các tế bào với số lượng lớn sau khi tu luyện cũng có thể hỗ trợ việc phân tích
tính đa dạng của vi sinh vật trong thực phẩm sau khi chiết DNA trực tiếp. Nó có thể hữu ích để hiểu được các loài được tìm thấy trong các cấu DGGE đang canh tác và cho dù có thỏa thuận hoặc không thống nhất giữa các kết quả thu được bằng phương pháp PCR-DGGE từ chiết DNA trực tiếp và phát hiện các loài sau khi trồng. Ví dụ, so sánh hồ sơ DGGE của nước khoáng và dấu vân tay của các mẫu mạ của các vùng biển tương tự, Dewettinck et al. (2001) thành lập các tỷ lệ phần trăm của các loài noncultivable trong mẫu nước khoáng đóng chai của họ. Röling et al. (2001) đã sử dụng phương pháp này để điều tra sự năng động của cộng đồng canh tác trong sản xuất đậu vani từ lô khác nhau. Các tác giả có thể liên hệ số lượng vi khuẩn đếm được trên phương tiện truyền thông với sự đa dạng về số lượng của các loài thống trị tất cả các giai đoạn cụ thể của quá trình. Hơn nữa, việc phân tích các cấu DGGE số lượng lớn cho phép quan sát sự thay đổi của các thành viên cộng đồng canh tác sau cuộc điều trị nhiệt độ và để làm nổi bật sự hiện diện của các loài không nuôi cấy bằng cách so sánh các cấu hình tương tự với dấu vân tay DGGE của DNA trực tiếp chiết xuất từ các mẫu (RO ling et al., 2001). Tương tự như vậy, Ercolini et al.
(2003a) nhận ra rằng các loài Lactococcus sử dụng như khởi trong pho mát Stilton không thể được phân lập từ các sản phẩm cuối cùng. Trong thực tế, các loài đã được phục hồi như ban nhạc DGGE trong hồ sơ Stilton nhưng không phải từ các hồ sơ số lượng lớn từ các tấm đếm được. Hơn nữa, Ercolini et al. (2001b) mở rộng số lượng các loài được xác định trong NWCs cho sản xuất pho mát Mozzarella bằng cách sắp xếp các băng DGGE từ profile số lượng lớn phát sinh từ phương tiện truyền thông cụ thể; Kết quả này có thể chỉ ra rằng thông tin đôi khi lấy về sự đa dạng của vi sinh vật duy nhất từ các cấu DGGE sau một chiết DNA trực tiếp từ một mẫu thức ăn không thể đủ, và tu luyện mà cũng nên được xem xét. Phân tích của các cấu DGGE lấy từ tế bào số lượng lớn cung cấp một hình ảnh cộng đồng canh tác, trong khi đồng thời cho phép các thông tin sinh thái để có được. Ercolini et al. (2001b) tính vào NWCs cho sản xuất pho mát Mozzarella dân số streptococci mesophilic 108 cfu ml? 1, nhưng nhận ra, sau khi phân tích PCR-DGGE lớn của tất cả các độ pha loãng, đó là loài duy nhất đạt trị giá 108 là S. thermophilus ưa nhiệt và cầu khuẩn mesophilic chỉ hiện ở nồng độ 104 cfu ml? 1. Một ứng dụng mới của phương pháp này gần đây đã được báo cáo bởi Miambi et al. (2003). Các phân tích PCRDGGE được thực hiện trên DNA chiết xuất từ các nền văn hóa phong phú trong môi trường lỏng thích hợp sử dụng cho các số có xác nhất (MPN) tội của mẫu bột sắn. Các phân tích cho phép để xác định các loài ưu thế xảy ra ở các độ pha loãng cao nhất; Hơn nữa, nó đã có thể xác định các loài đó đã không xảy ra trong các cấu DGGE phát sinh từ DNA trực tiếp chiết xuất từ các mẫu sắn. Miambi et al. (2003) cũng có thể đánh giá sự phù hợp của các phương tiện truyền thông văn hóa làm việc và kết luận rằng không ai trong số các chất nền có thể bao gồm tất cả các thành viên đại diện của các cộng đồng vi khuẩn và một loạt các phương tiện truyền thông chọn lọc nên được sử dụng để đếm và phân lập vi khuẩn trong quá trình lên men sắn. Thủ tục này cũng có thể
điều tra về tính lựa chọn của một số phương tiện truyền thông văn hóa. Trong một số trường hợp, trên thực tế, nó đã chỉ ra rằng sự lựa chọn của một số phương tiện truyền thông văn hóa cho LAB là không thỏa đáng (Ercolini et al., 2001b, 2003a).
7. Mô hình tham khảo: đánh dấu '' làm từ loài ''
Một thay thế cho các trình tự của các băng DGGE để xác định các loài vi sinh vật xảy ra trong một hồ sơ DGGE đang xây dựng một thang phân tử sử dụng 16S rDNA amplicon của loài đại diện của thực phẩm để phân tích. Các sản phẩm PCR từ mẫu DNA trực tiếp chiết xuất từ thực phẩm được chạy trong một gel DGGE cùng với một hỗn hợp của các amplicon của loài tham chiếu như bậc thang. Việc xác định các vi khuẩn sau đó được thực hiện bằng cách so sánh các khoảng cách di cư amplicon PCR trong DGGE gel với những người của các chủng loại hiện diện trong nhận dạng
bậc thang. Mặc dù thủ tục này là dễ dàng hơn nhiều so với các trình tự của các ban nhạc, nó không hoàn toàn đảm bảo một xác định rõ ràng do một số mặt hạn chế tiềm ẩn. Một số tác giả báo cáo trường hợp của comigration của amplicon từ các loài khác nhau trong gel DGGE (Ercolini et al, 2001a, 2003a;. Van Beek và Priest, 2002;. Meroth et al, 2003). Điều này là do
nhiều loài vi khuẩn có liên quan chặt chẽ và đoạn 16S rDNA phân tích có thể không chứa sự khác biệt lớn cho phép tách ra bằng cách DGGE.