Multilocus hạn chế đánh máy.
Tất cả các chủng O147 E.coli (chủng thiết lập 1 cộng với các chủng thêm bị cô lập trước năm 1996) được phân tích bằng multilocus gõ hạn chế (MLRT) (5). Bảy gen Dọn dẹp phòng hàng đã được lựa chọn để phân tích dựa trên công việc trước đây của Reid et al. (13). Mồi được thiết kế sử dụng phần mềm DNAMAN (Lynnon Corp, Quebec, Canada) và đã được lựa chọn từ các trình tự công bố của E. coli K12 (chủng MG1655) hệ gen (Table (Bảng 1) .1). DNA được phân lập từ mỗi chủng, và một PCR 50 ml đã được thực hiện cho mỗi một trong bảy gen. Các hỗn hợp PCR bao gồm DNA của vi khuẩn, 0.015 mM của mỗi lớp sơn lót, 0,2 mM triphosphate deoxynucleoside (Roche, Thụy Sĩ), 3 mM MgCl, 1 × Amplitaq Vàng đệm, và 2,5 U Amplitaq vàng DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ ). Sau khi ủ ban đầu ở 95 ° C trong 10 phút, 40 chu kỳ khuếch đại đã được chạy, bao gồm biến tính ở 94 ° C trong 30 giây, ủ ở 55 ° C trong 30 giây, và mở rộng ở 72 ° C trong 90 giây. Một phần mở rộng cuối cùng đã được thực hiện ở 72 ° C trong 10 phút, và các mẫu được tổ chức tại 4 ° C cho đến khi họ được phân tích. Các sản phẩm gen đã được giải quyết trên gel agarose 2%, và các băng DNA được hình dung bằng cách nhuộm gel với ethidium bromide. Sản phẩm gen (20 ml) được ủ với 5 U của một trong hai HpaII hoặc HhaI hạn chế enzyme (Table (Bảng 1) 1) trong bộ đệm thích hợp ở 37 ° C qua đêm, và các mảnh vỡ hạn chế đã được tách trên gel agarose 4%. Quyết định sử dụng một enzyme giới hạn đặc biệt đối với phân mảnh một sản phẩm PCR được dựa trên mô hình dải dự đoán cho rằng sản phẩm PCR bằng chuỗi E. coli K12. E. coli MG1655 đã được sử dụng như một điều khiển tích cực, và E. coli O157: H7 căng 933 đã được đưa vào như một outlier.
đang được dịch, vui lòng đợi..