Sensitivity of RT-PCR testing sampl

Sensitivity of RT-PCR testing samples from organs
Tissue homogenates from lung and kidney of an
NDV-infected animal killed at day 5 p.i. were
positive up to a 103 dilution when tested by virus
isolation on embryonated eggs. When tested by RTPCR,
lung homogenate could be diluted (before
RNA extraction) up to 102 a positive result still
obtained. Kidney samples could be diluted up to
103 and were positive.
When lung or kidney tissue from all animals
experimentally infected or contact-infected, respectively,
were tested by RT-PCR and virus isolation
on embryonated eggs, it was possible to detect more
NDV-positive animals by RT-PCR than by virus
isolation. Twenty of 36 investigated animals were
positive by RT-PCR, 13 were positive by virus
isolation. Two animals were positive by virus isolation but negative by RT-PCR, whereas nine
were positive by RT-PCR but negative by virus
isolation. These nine animals were already seropositive
and killed later than 10 days after
infection or later than 8 days after contact infection,
respectively.
Sensitivity of RT-PCR testing allantoic fluid or
vaccines (data not shown)
Allantoic fluid from embryos, inoculated with
tenfold dilution series of tissue from lung or kidney
from an NDV-infected animal killed at day 5 p.i.,
that were positive in HA test were also positive in
RT-PCR and vice versa. Similar results were
obtained when allantoic fluid from embryos inoculated
with tenfold dilution series of APMV-
1/chicken/Switzerland/Safnern/95 used as inoculate
for the time course experiment was tested.
Allantoic fluid from embryos inoculated with
TAD ND vac LaSota, TAD ND vac HitchnerB1 or
APMV-1/chicken/NorthernIreland/Ulster/2C
showed an HA titre of 1:16, 1:16 and 1:512,
respectively. RT-PCR yielded a positive signal for
the allantoic fluids diluted 1:32, 1:32 and 1:512,
respectively. Therefore, RT-PCR proved to be at
least as sensitive as the HA test.
Vaccines TAD ND vac LaSota and TAD ND vac
HitchnerB1 could be diluted up to 1:1000 to give a
specific DNA band in RT-PCR. Therefore, it was
possible to recognize a NDV-titre of 102.7 EID50 per
RT-PCR assay.
Comparison of two different sets of RT-PCR
primers
Using vaccines TAD ND vac LaSota and TAD ND
vac HitchnerB1, the sensitivity of the RT-PCR
using primer pair NCD7/NCD8 was equal to the
sensitivity using the protocol of St¨auber et al.
(1995) with primers NCD3/NCD4. With both
primer pairs, the vaccines could be diluted up to
1:1000 to give a specific DNA band (data not
shown). In contrast to primer pair NCD4/NCD3
that give a very strong unspecific band close to the
specific band with primer pair NCD7/NCD8, such
bands did not appear (data not shown).
Specificity of RT-PCR
The specificity of the method was confirmed by
testing other APMV strains isolated from allantoic
fluids, which yielded no specific DNA bands on the
agarose gel (not shown).
Restriction enzyme analysis of RT-PCR products
from field isolate APMV-1/chicken/Switzerland/
Safnern/95, APMV-1/chicken/Switzerland/Schaffhausen/
96, and strains APMV-1/chicken/NorthernIreland/
Ulster/2C, APMV-1/chicken/LaSota (TAD
ND vac LaSota) and APMV-1/chicken/HitchnerB1
(TAD ND vac HitchnerB1) with Alu I yielded the predicted specific DNA bands of 79, 67, and 36 bp,
respectively for strains Safnern, Schaffhausen, and
Ulster, or 121 and 61 bp for the vaccine strains
LaSota TAD and HitchnerB1 TAD (Figure 3).
Discussion
NDV in clinical samples from experimentally and
contact-infected chickens could be quickly, easily
and reliably detected by RT-PCR, as early as 1 day
p.i. in experimentally infected chickens. This demonstrates
that RT-PCR is a rapid and efficient
method for the detection of NDV in tissues as well
as faecal samples. Sample homogenization, RNA
extraction and RT-PCR can be completed within 1
day. Although we performed RNA extraction with
previously frozen samples, it also is possible to use
fresh tissue and faeces.
It was possible to obtain positive results from
faecal samples in the inoculated animals as well as
in the contact animals. Investigation of faeces from
wild birds could be an important tool for testing live
birds for intestinal NDV infection. These infections
could play an important role within the spread of
NDV, particularly of the less virulent strains
(Lancaster & Alexander, 1975). NDV excretion in
faeces has been previously described (Parede &
Young, 1990; Alexander, 1991; Russell, 1994) but,
because of bacterial contamination and toxic substances,
it is difficult to perform NDV detection in
faeces by virus isolation in embryonated eggs;
therefore, RT-PCR is a valuable alternative.
Although PCR-inhibiting substances in faecal samples
have also been reported (Wilde et al., 1990),
several RT-PCR protocols have been developed for
the detection of other viruses in faeces (Arola et al.,
1996; Uwatoko et al., 1996; Paton et al., 1997), but
the use of TRIzol® Reagent to our knowledge has
not been reported for faecal samples. Le Gall et al.
(1998) used TRIzol® LS Reagent for RNA extraction
from organ samples. Furthermore, storage of
samples in TRIzol® Reagent before RNA extraction
enables conservation of viral RNA for weeks
even at room temperature (Hofmann et al., 1999).
Screening tissue and faecal samples from experimentally
infected chickens using RNA extraction
and RT-PCR has not yet been reported, although
systematic testing of tissue samples from experimentally
NDV-infected chickens using embryonated
eggs has been documented (Parede & Young,
1990).
Concerning the sensitivity of RT-PCR, it could be
shown that NDV detection in allantoic fluid was as
sensitive as HA test. Although RT-PCR reagents
and equipment are very expensive, holding chickens
only for supply of erythrocytes for HA test can
be more expensive for a laboratory that uses RTPCR
in routine diagnostics but not the HA test. The
described RT-PCR is profitable for identification of
NDV in allantoic fluid of eggs inoculated with an
unknown haemagglutinating virus. The sensitivity of the RT-PCR was lower than the sensitivity of
virus isolation in embryonated eggs if allantoic
fluid containing NDV was titrated and tested with
both methods. However, in the time course experiment,
RT-PCR from tissue was as sensitive as virus
isolation in embryonated eggs; it was possible to
detect NDV by RT-PCR in every diseased animal
(day 1 to 28 of the experiment) by testing tissue
from different organs.
RT-PCR in animals that had already developed
antibodies against NDV was more sensitive than
virus isolation in embryonated eggs. After NDV
antibody titres increased, the frequency of NDV
virus isolation decreased, which is in agreement
with earlier reports (Westbury et al., 1984; Bell &
Moloudi, 1988). The present findings that NDV
detection by RT-PCR lasted longer after infection
than virus detection using embryonated eggs suggest
that NDV neutralized by antibodies could be
detected by RT-PCR but not by virus isolation.
Tissue samples from lung and kidney were chosen
for the comparison of sensitivity of RT-PCR and
virus isolation on embryonated eggs for the following
reasons: (i) these organs were most consistently
positive in RT-PCR (Figure 2); (ii) they were
described as being suitable for virus isolation in
embryonated eggs (Parede & Young, 1990; Bankowski,
1992; R. Morgenstern, personal communication,
Veterinary Pathology, University of Berne);
and (iii) they are less prone to bacterial
contamination.
High background signals mainly in the highly
parenchymatous organs, such as brain and liver, that
sometimes made it difficult to judge the RT-PCR
could be caused by unspecific cellular RNA, but
could be avoided by a 1:10 dilution of the RNA
(Figure 1). Specificity of the RT-PCR was found to
be high; no mock-infected animal showed any
positive reaction and no cross-reactions with other
APMV-strains occurred.
Since many different NDV strains are known
with different organ tropism, and no single tissue
was always RT-PCR-positive in the present study, it
is recommended to perform testing using faeces and
tissues from different organs (conjunctiva, trachea,
lung, proventriculus, caecal tonsils, kidney) simultaneously,
particularly if they are macroscopically
changed. This recommendation is further supported
by investigating chickens infected with vaccine
virus LaSota and HitchnerB1. In these animals,
virus could be detected by RT-PCR mainly in tissue
from respiratory tract, whereas in chickens infected
with APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/95,
other organs also yielded positive result. Another
possibility to achieve a higher diagnostic sensitivity
is the use of more than one set of primers to exclude
false negative results caused by genome variability.
This is one important reason why we have chosen
primer set NCD7/NCD8 in addition to NDC3/
NCD4 (St¨auber et al., 1995). Results of the initial
experiment also demonstrated the practicability of RT-PCR for lentogenic strains such as LaSota and
HitchnerB1. In the initial experiment, virus detection
in tissue samples from the respiratory tract and
the conjunctiva was not surprising because the
animals were infected conjunctival-orall y. In the
time course experiment, as expected, conjunctivas
of the conjunctival-orally inoculated chickens were
first positive already at day 1 and 2 p.i. In contrast,
the contact-infected animals showed the first positive
reactions in lungs, kidneys and caecal tonsils 3
days post-exposure and were not positive in conjunctivas
before day 6. The reason for the RT-PCRnegative
proventriculus and intestine in the animals
killed at days 4 and 5 p.i. (Table 1), although faecal
samples were positive at the same time, could be
explained by the fact that the faecal sample is a
homogenate in itself and can be used for RNA
extraction without further processing. It is also
possible that only distinct parts of the intestinal tract
contain NDV at a given time, and therefore faecal
samples passaged through the whole intestine can
be enriched with high amounts of N

Kết quả (Việt) 1:

Độ nhạy của RT-PCR thử nghiệm mẫu từ bộ phận cơ thểHomogenates mô từ phổi và thận của mộtNhiễm NDV động vật bị giết tại ngày 5 p.i.tích cực đến một pha loãng 103 khi thử nghiệm của viruscô lập trên embryonated trứng. Khi thử nghiệm của RTPCR,phổi homogenate có thể được pha loãng (trước khiKhai thác RNA) lên đến 102 một tích cực gây ra vẫn cònthu được. Thận mẫu có thể được pha loãng đến103 và được tích cực.Khi phổi hoặc thận mô từ tất cả động vậtthử nghiệm bị nhiễm hoặc số liên lạc bị nhiễm, tương ứng,đã được thử nghiệm bởi sự cô lập Đảng Cộng sản Romania RT và virusembryonated trứng, nó đã có thể phát hiện nhiều hơn nữaĐộng vật NDV tích cực của Đảng Cộng sản Romania RT hơn do vi rútcô lập. Hai mươi vật tra 36tích cực của Đảng Cộng sản Romania RT, 13 là tích cực do vi rútcô lập. Hai loài động vật đã được tích cực bởi sự cô lập virus nhưng tiêu cực bởi RT-Đảng Cộng sản Romania, trong khi chíntích cực của Đảng Cộng sản Romania RT nhưng tiêu cực bởi viruscô lập. Các loài động vật chín đã seropositivevà sau đó giết chết hơn 10 ngày sau khinhiễm trùng hoặc muộn hơn 8 ngày sau khi nhiễm trùng liên lạc,tương ứng.Độ nhạy của RT-PCR thử nghiệm allantoic chất lỏng hoặcvắc xin (dữ liệu không hiển thị)Các chất lỏng allantoic từ phôi, tiêm chủng vớimười lần pha loãng loạt mô từ phổi hoặc thậntừ một động vật nhiễm NDV bị giết tại ngày 5 Pi,mà đã được tích cực trong thử nghiệm Hà cũng đã được tích cực trongRT-Đảng Cộng sản Romania và ngược lại. Kết quả tương tựthu được khi các chất lỏng allantoic từ phôi tiêm chủngvới mười lần pha loãng loạt của APMV-1/gà/Thụy sĩ/Safnern/95 được sử dụng như cấycho các khóa học thời gian thử nghiệm đã được thử nghiệm.Các chất lỏng allantoic từ phôi tiêm chủng vớiTAD ND vac LaSota, TAD ND vac HitchnerB1 hoặcAPMV-1/ gà/NorthernIreland/Ulster / 2Ccho thấy một thị Hà 1:16, 1:16 và 1:512,tương ứng. RT-PCR mang lại một tín hiệu tích cực choCác chất lỏng allantoic pha loãng 1:32, 1:32 và 1:512,tương ứng. Vì vậy, Đảng Cộng sản Romania RT chứng minh là lúcít nhất là nhạy cảm như thử nghiệm HA.Vắc xin TAD ND vac LaSota và TAD ND vacHitchnerB1 có thể được pha loãng đến 1:1000 để cung cấp cho mộtBan nhạc cụ thể DNA ở RT-Đảng Cộng sản Romania. Do đó, nó đãcó thể nhận ra một thị NDV của 102.7 EID50 mộtKhảo nghiệm RT-Đảng Cộng sản Romania.So sánh hai bộ khác nhau của RT-PCRchất nền, mồiSử dụng vắc xin TAD ND vac LaSota và TAD NDVAC HitchnerB1, sự nhạy cảm của RT-PCRbằng cách sử dụng mồi cặp NCD7/NCD8 được bằng cácnhạy cảm bằng cách sử dụng giao thức của St¨auber et al.(1995) với lớp lót NCD3/NCD4. Với cả haiCặp mồi, các vắc-xin có thể được pha loãng đến1:1000 để cung cấp cho một ban nhạc DNA cụ thể (dữ liệu khôngHiển thị). Trái ngược với mồi cặp NCD4/NCD3đó cung cấp cho một ban nhạc unspecific rất mạnh mẽ gần gũi với cáccác ban nhạc cụ thể với mồi cặp NCD7/NCD8, chẳng hạnBan nhạc đã không xuất hiện (dữ liệu không hiển thị).Đặc trưng của RT-PCRCác đặc trưng của các phương pháp đã được xác nhận bởithử nghiệm khác chủng APMV bị cô lập từ allantoicchất lỏng, mà mang lại không có ban nhạc DNA cụ thể trên cácagarose gel (không hiển thị).Hạn chế enzyme phân tích của RT-PCR sản phẩmtừ lĩnh vực cô lập APMV-1/gà/Thụy sĩ /Safnern/95, APMV-1/gà/Thụy sĩ/Schaffhausen /96, và chủng APMV-1/gà/NorthernIreland /Ulster / 2C, APMV-1/gà/LaSota (TADND vac LaSota) và APMV-1/gà/HitchnerB1(TAD ND vac HitchnerB1) với Alu tôi mang lại những ban nhạc DNA cụ thể dự đoán của 79, 67, và 36 bp,tương ứng cho chủng Safnern, Schaffhausen, vàUlster, hoặc 121 và 61 bp cho chủng vắc xinLaSota TAD và HitchnerB1 TAD (hình 3).Thảo luậnNDV trong lâm sàng mẫu từ thử nghiệm vàcon gà nhiễm bệnh liên hệ có thể là một cách nhanh chóng, dễ dàngvà đáng tin cậy được phát hiện bởi RT-PCR, sớm nhất là 1 ngàyPi ở gà bằng thực nghiệm bị nhiễm bệnh. Điều này chứng tỏRT-PCR là một nhanh chóng và hiệu quảCác phương pháp để phát hiện các NDV trong mô là tốtnhư faecal mẫu. Mẫu homogenization, RNAkhai thác và Đảng Cộng sản Romania RT có thể được hoàn thành trong vòng 1ngày. Mặc dù chúng tôi thực hiện RNA khai thác vớitrước đây bị đóng băng mẫu, nó cũng có thể sử dụngtươi mô và phân.Nó đã có thể để có được các kết quả tích cực từfaecal mẫu trong các loài động vật inoculated cuõng nhötrong các loài động vật liên lạc. Điều tra phân từchim hoang dã có thể là một công cụ quan trọng để thử nghiệm trực tiếpchim cho đường ruột NDV nhiễm trùng. Các bệnh nhiễm trùngcó thể đóng một vai trò quan trọng trong sự lây lan củaNDV, đặc biệt là của các chủng ít độc(Lancaster & Alexander, 1975). NDV bài tiết trongphân đã được mô tả trước đó (Parede &Trẻ, 1990; Alexander, năm 1991; Russell, 1994) nhưng,vì ô nhiễm vi khuẩn và các chất độc hại,nó là khó khăn để thực hiện NDV phát hiện tạiphân bởi virus bị cô lập trong embryonated trứng;Vì vậy, RT-PCR là một lựa chọn có giá trị.Mặc dù Đảng Cộng sản Romania ức chế chất trong faecal mẫucũng đã là báo cáo (Wilde et al., 1990),một số RT-PCR giao thức đã được phát triển chophát hiện virus khác trong phân (Arola et al.,năm 1996; Uwatoko và ctv., 1996; Paton et al., 1997), nhưngviệc sử dụng của TRIzol ® tinh khiết để kiến thức của chúng tôi cókhông được báo cáo cho faecal mẫu. Le Gall et al.(1998) sử dụng TRIzol ® LS tinh khiết cho khai thác RNAtừ cơ quan mẫu. Hơn nữa, lưu trữmẫu trong TRIzol ® hoá trước khi khai thác RNAcho phép bảo tồn của virus ARN trong tuầnngay cả ở nhiệt độ phòng (Hofmann và ctv., 1999).Kiểm tra mô và faecal mẫu từ thử nghiệmcon gà nhiễm bệnh bằng cách sử dụng khai thác RNAvà Đảng Cộng sản Romania RT đã không được được báo cáo, mặc dùthử nghiệm hệ thống của mẫu mô từ thử nghiệmNhiễm NDV gà bằng cách sử dụng embryonatedtrứng đã là tài liệu (Parede & Young,năm 1990).Liên quan đến sự nhạy cảm của RT-Đảng Cộng sản Romania, nó có thểHiển thị rằng NDV phát hiện trong allantoic chất lỏng nhưnhạy cảm như thử nghiệm HA. Mặc dù thuốc thử RT-PCRvà thiết bị là rất tốn kém, đang nắm giữ con gàchỉ đối với nguồn cung cấp của hồng cầu cho Hà thử nghiệm có thểđắt hơn cho một phòng thí nghiệm sử dụng RTPCRchẩn đoán thông thường nhưng không phải thử nghiệm HA. CácRT Đảng Cộng sản Romania được mô tả là có lợi nhuận để xác định củaNDV trong các chất lỏng allantoic trứng tiêm chủng với mộtkhông biết haemagglutinating virus. Độ nhạy của RT-PCR là thấp hơn độ nhạy củavirus bị cô lập trong embryonated trứng nếu allantoicchất lỏng có chứa NDV được chuẩn độ và thử nghiệm vớicả hai phương pháp. Tuy nhiên, trong thời gian khóa học thử nghiệm,RT-Đảng Cộng sản Romania từ mô là là nhạy cảm như virussự cô lập trong embryonated trứng; nó đã có thểphát hiện NDV bởi Đảng Cộng sản Romania RT trong mọi động vật bị bệnh(1 đến 28 ngày của thử nghiệm) bằng cách kiểm tra môtừ cơ quan khác nhau.RT-Đảng Cộng sản Romania ở động vật có đã phát triểncác kháng thể chống lại NDV là nhạy cảm hơn so vớivirus bị cô lập trong embryonated trứng. Sau khi NDVkháng thể titres tăng lên, tần số của NDVcô lập virus giảm, mà là trong thỏa thuậnvới báo cáo trước đó (Westbury et al., năm 1984; Chuông &Moloudi, năm 1988). Những phát hiện nay là NDVphát hiện bởi Đảng Cộng sản Romania RT kéo dài lâu hơn sau khi lây nhiễmhơn phát hiện vi rút bằng cách sử dụng embryonated trứng đề nghịđó NDV vô hiệu hóa do kháng thể có thểđược phát hiện bởi Đảng Cộng sản Romania RT nhưng không phải bởi virus bị cô lập.Mẫu mô từ phổi và thận được chọnđể so sánh độ nhạy cảm của RT-Đảng Cộng sản Romania vàvirus cô lập trên embryonated trứng cho sau đâylý do: (i) các cơ quan đã đặt một cách nhất quántích cực trong Đảng Cộng sản Romania RT (hình 2); (ii) họ đãMô tả như là thích hợp cho virus bị cô lập trongembryonated eggs (Parede & Young, 1990; Bankowski,1992; R. Morgenstern, personal communication,Veterinary Pathology, University of Berne);and (iii) they are less prone to bacterialcontamination.High background signals mainly in the highlyparenchymatous organs, such as brain and liver, thatsometimes made it difficult to judge the RT-PCRcould be caused by unspecific cellular RNA, butcould be avoided by a 1:10 dilution of the RNA(Figure 1). Specificity of the RT-PCR was found tobe high; no mock-infected animal showed anypositive reaction and no cross-reactions with otherAPMV-strains occurred.Since many different NDV strains are knownwith different organ tropism, and no single tissuewas always RT-PCR-positive in the present study, itis recommended to perform testing using faeces andtissues from different organs (conjunctiva, trachea,lung, proventriculus, caecal tonsils, kidney) simultaneously,particularly if they are macroscopicallychanged. This recommendation is further supportedby investigating chickens infected with vaccinevirus LaSota and HitchnerB1. In these animals,virus could be detected by RT-PCR mainly in tissuefrom respiratory tract, whereas in chickens infectedwith APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/95,other organs also yielded positive result. Anotherpossibility to achieve a higher diagnostic sensitivityis the use of more than one set of primers to excludefalse negative results caused by genome variability.This is one important reason why we have chosenprimer set NCD7/NCD8 in addition to NDC3/NCD4 (St¨auber et al., 1995). Results of the initialexperiment also demonstrated the practicability of RT-PCR for lentogenic strains such as LaSota andHitchnerB1. In the initial experiment, virus detectionin tissue samples from the respiratory tract andthe conjunctiva was not surprising because theanimals were infected conjunctival-orall y. In thetime course experiment, as expected, conjunctivasof the conjunctival-orally inoculated chickens werefirst positive already at day 1 and 2 p.i. In contrast,the contact-infected animals showed the first positivereactions in lungs, kidneys and caecal tonsils 3days post-exposure and were not positive in conjunctivasbefore day 6. The reason for the RT-PCRnegativeproventriculus and intestine in the animalskilled at days 4 and 5 p.i. (Table 1), although faecalsamples were positive at the same time, could beexplained by the fact that the faecal sample is ahomogenate in itself and can be used for RNAextraction without further processing. It is alsopossible that only distinct parts of the intestinal tractcontain NDV at a given time, and therefore faecalsamples passaged through the whole intestine canbe enriched with high amounts of N

Kết quả (Việt) 2:

Độ nhạy của RT-PCR với mẫu thử từ các cơ quan
homogenates mô phổi và thận của một
động vật NDV nhiễm giết chết vào ngày thứ 5 pi đã
tích cực lên đến một độ pha loãng 103 khi được thử nghiệm bởi virus
phân lập trên trứng có phôi. Khi thử nghiệm bởi RTPCR,
đồng chất phổi có thể được pha loãng (trước khi
chiết RNA) lên đến 102 kết quả dương tính vẫn
thu được. Mẫu thận có thể được pha loãng đến
103 và đã được tích cực.
Khi phổi hoặc mô thận từ tất cả các động vật
thí nghiệm bị nhiễm hoặc tiếp xúc nhiễm, tương ứng,
đã được thử nghiệm bằng RT-PCR và phân lập virus
trên trứng có phôi, nó đã có thể phát hiện nhiều
NDV- động vật tích cực bằng RT-PCR hơn bởi virus
phân lập. Hai mươi của 36 loài động vật điều tra đã
tích cực bằng RT-PCR, 13 là tích cực bởi virus
phân lập. Hai động vật đã tích cực bằng phân lập virus nhưng tiêu cực bằng RT-PCR, trong khi chín
là tích cực bởi RT-PCR nhưng tiêu cực bởi virus
phân lập. Những con thú này đã chín huyết thanh dương tính
và giết chết sau hơn 10 ngày sau khi
nhiễm trùng hoặc muộn hơn 8 ngày sau khi nhiễm liên lạc,
tương ứng.
Độ nhạy của xét nghiệm RT-PCR allantoic chất lỏng hoặc
vắc-xin (dữ liệu không hiển thị)
Allantoic chất lỏng lấy từ phôi thai, tiêm
mười lần chuỗi pha loãng mô từ phổi hoặc thận
từ một con vật NDV nhiễm giết chết vào ngày thứ 5 pi,
đó là tích cực trong HA kiểm tra cũng đã tích cực trong
RT-PCR và ngược lại. Kết quả tương tự cũng được
thu được khi allantoic chất lỏng từ các phôi được cấy
với mười lần pha loãng loạt APMV-
1 / gà / Switzerland / Safnern / 95 sử dụng như tiêm chủng
cho các thí nghiệm thời gian khóa học đã được thử nghiệm.
Allantoic chất lỏng từ các phôi được cấy
TAD NĐ VAC LaSota, TAD ND vac HitchnerB1 hoặc
APMV-1 / gà / NorthernIreland / Ulster / 2C
cho thấy một hiệu giá HA 1:16, 1:16 và 1: 512,
tương ứng. RT-PCR thu được một tín hiệu tích cực cho
các dịch allantoic pha loãng 1:32, 1:32 và 1: 512,
tương ứng. Vì vậy, RT-PCR được chứng minh là tại
ít nhất là nhạy cảm như HA test.
Vắc xin TAD NĐ vac LaSota và TAD NĐ vac
HitchnerB1 có thể được pha loãng lên đến 1: 1000 để cung cấp cho một
band DNA cụ thể trong RT-PCR. Vì vậy, nó đã
có thể nhận ra một NDV-hiệu giá 102,7 EID50 mỗi
xét nghiệm RT-PCR.
So sánh hai bộ khác nhau của RT-PCR
mồi
Sử dụng vắc xin Tad NĐ vac LaSota và TAD NĐ
vac HitchnerB1, độ nhạy của RT-PCR
sử dụng cặp mồi NCD7 / NCD8 là bằng với
độ nhạy bằng cách sử dụng giao thức của Stauber et al.
(1995) với mồi NCD3 / NCD4. Với cả hai
cặp mồi, các loại vắc-xin có thể được pha loãng lên đến
1: 1000 để cung cấp cho một band DNA cụ thể (dữ liệu không
hiển thị). Ngược lại với cặp mồi NCD4 / NCD3
đó đưa ra một ban nhạc không đặc hiệu rất mạnh gần với
ban nhạc cụ với cặp mồi NCD7 / NCD8, như
các ban nhạc đã không xuất hiện (dữ liệu không hiển thị).
đặc hiệu của RT-PCR
đặc hiệu của phương pháp này đã được khẳng định bởi
thử nghiệm chủng APMV khác được phân lập từ allantoic
chất lỏng, mà mang lại không có dải DNA cụ thể trên
gel agarose (không hiển thị).
phân tích enzyme hạn chế các sản phẩm RT-PCR
từ trường cô lập APMV-1 / gà / Switzerland /
Safnern / 95, APMV- 1 / gà / Switzerland / Schaffhausen /
96, và các chủng APMV-1 / gà / NorthernIreland /
Ulster / 2C, APMV-1 / gà / LaSota (TAD
NĐ VAC LaSota) và APMV-1 / gà / HitchnerB1
(TAD NĐ vac HitchnerB1 ) với Alu tôi mang lại các băng DNA cụ thể dự đoán là 79, 67, và 36 bp,
tương ứng với chủng Safnern, Schaffhausen, và
Ulster, hoặc 121 và 61 bp cho các chủng vaccine
LaSota TAD và HitchnerB1 TAD (Hình 3).
Thảo luận
NDV trong các mẫu bệnh phẩm từ thực nghiệm và
gà xúc nhiễm có thể là một cách nhanh chóng, dễ dàng
và đáng tin cậy phát hiện bằng RT-PCR, sớm nhất là 1 ngày
pi ở gà gây nhiễm thực nghiệm. Điều này chứng tỏ
rằng RT-PCR là một nhanh chóng và hiệu quả
phương pháp để phát hiện các NDV trong các mô cũng
như mẫu phân. Đồng nhất mẫu, RNA
tách chiết và RT-PCR có thể được hoàn thành trong vòng 1
ngày. Mặc dù chúng tôi thực hiện chiết RNA với
mẫu đông lạnh trước đó, nó cũng có thể sử dụng
mô tươi và phân.
Đó là có thể đạt được kết quả tích cực từ
mẫu phân trong các động vật cấy cũng như
trong các động vật tiếp xúc. Điều tra của phân từ
các loài chim hoang dã có thể là một công cụ quan trọng để kiểm tra trực tiếp
cho chim nhiễm NDV ruột. Các bệnh nhiễm trùng
có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự lây lan của
NDV, đặc biệt là của các chủng ít độc lực
(Lancaster & Alexander, 1975). NDV bài tiết trong
phân đã được mô tả trước đây (Parede &
Young, năm 1990; Alexander, 1991; Russell, 1994), nhưng,
vì nhiễm vi khuẩn và các chất độc hại,
nó là khó khăn để thực hiện phát hiện NDV trong
phân bằng phân lập virus trong trứng có phôi;
do đó , RT-PCR là một thay thế có giá trị.
Mặc dù PCR-ức chế các chất trong mẫu phân
cũng đã được báo cáo (Wilde et al., 1990),
một số giao thức RT-PCR đã được phát triển cho
việc phát hiện virus khác trong phân (Arola et al .,
1996;. Uwatoko et al, 1996; Paton et al, 1997), nhưng.
việc sử dụng các thuốc thử TRIzol® để kiến thức của chúng tôi đã
không được báo cáo cho mẫu phân. Le Gall et al.
(1998) sử dụng TRIzol® LS Thuốc thử cho chiết RNA
từ mẫu nội tạng. Hơn nữa, lưu trữ các
mẫu trong TRIzol® thuốc thử trước khi chiết RNA
cho phép bảo tồn của RNA virus cho tuần
ngay cả ở nhiệt độ phòng (Hofmann et al 1999.,).
mô Sàng lọc và mẫu phân từ thực nghiệm
gà bị nhiễm sử dụng chiết RNA
và RT-PCR có không chưa được báo cáo, mặc dù
thử nghiệm hệ thống các mẫu mô từ thực nghiệm
gà NDV nhiễm sử dụng phôi
trứng đã được ghi nhận (Parede & Young,
1990).
Liên quan đến sự nhạy cảm của RT-PCR, nó có thể được
phát hiện chỉ ra rằng NDV trong dịch allantoic là như
nhạy cảm như HA test. Mặc dù thuốc thử RT-PCR
và thiết bị rất đắt tiền, giữ con gà
chỉ để cung cấp các hồng cầu cho HA thử nghiệm có thể
là đắt tiền hơn cho một phòng thí nghiệm có sử dụng RTPCR
trong chẩn đoán thường nhưng không phải là kiểm tra HA. Các
mô tả RT-PCR có ích cho việc xác định các
NDV trong dịch allantoic trứng được tiêm một
loại virus haemagglutinating không rõ. Độ nhạy của RT-PCR là thấp hơn so với độ nhạy của
phân lập virus trong trứng có phôi nếu allantoic
chất lỏng có chứa NDV được tăng liều và thử nghiệm với
cả hai phương pháp. Tuy nhiên, trong cuộc thử nghiệm thời gian khóa học,
RT-PCR từ mô đã là nhạy cảm như virus
phân lập trong trứng có phôi; nó đã có thể
phát hiện NDV bằng RT-PCR trong mỗi con vật bị bệnh
(ngày 1-28 của thí nghiệm) bằng cách kiểm tra mô
từ các cơ quan khác nhau.
RT-PCR trên động vật đã phát triển
các kháng thể chống lại NDV nhạy cảm hơn
phân lập virus trong phôi trứng. Sau NDV
hiệu giá kháng thể tăng lên, tần số của NDV
phân lập virus giảm, đó là trong thỏa thuận
với các báo cáo trước đó (Westbury et al, 1984;. Bell &
Moloudi, 1988). Những phát hiện rằng NDV
phát hiện bằng RT-PCR kéo dài lâu hơn sau khi bị nhiễm trùng
hơn phát hiện virus khi sử dụng trứng có phôi đề nghị
rằng NDV trung hòa bởi các kháng thể có thể được
phát hiện bằng RT-PCR nhưng không bằng phân lập virus.
mẫu mô phổi và thận đã được lựa chọn
để so sánh độ nhạy của RT-PCR và
phân lập virus trên trứng có phôi sau
lý do: (i) các cơ quan này là nhất quán nhất
tích cực trong RT-PCR (Hình 2); (Ii) họ được
mô tả như là thích hợp cho việc phân lập virus trong
trứng có phôi (Parede & Young, năm 1990; Bankowski,
1992; R. Morgenstern, thông tin liên lạc cá nhân,
thú y Bệnh học, Đại học Berne);
và (iii) họ thường ít bị vi khuẩn
ô nhiễm.
nền cao hiệu chủ yếu trong đánh giá cao
các cơ quan nhu mô, như não, gan, mà
đôi khi làm cho nó khó khăn để đánh RT-PCR
có thể được gây ra bởi không đặc hiệu RNA tế bào, nhưng
có thể tránh được bằng cách pha loãng 1:10 của RNA
(Hình 1). Đặc trưng của RT-PCR đã được tìm thấy
là cao; không có vật giả nhiễm cho thấy bất kỳ
phản ứng tích cực và không có phản ứng chéo với khác
APMV-chủng xảy ra.
Vì nhiều chủng NDV khác nhau được biết đến
với ái tính cơ quan khác nhau, và không có mô duy nhất
là luôn luôn RT-PCR dương tính trong nghiên cứu này, nó
được khuyến khích để thực hiện thử nghiệm bằng cách sử dụng phân và
mô từ các cơ quan khác nhau (kết mạc, khí quản,
phổi, proventriculus, amidan manh tràng, thận) cùng một lúc,
đặc biệt nếu họ đang vĩ mô
thay đổi. Khuyến nghị này được hỗ trợ thêm
bằng cách điều tra gà bị nhiễm vắc-xin
rút LaSota và HitchnerB1. Trong các loài động vật,
virus có thể được phát hiện bằng RT-PCR chủ yếu trong các mô
ở đường hô hấp, trong khi đó ở gà nhiễm
với APMV-1 / gà / Switzerland / Safnern / 95,
các cơ quan khác cũng mang lại kết quả tích cực. Một
khả năng để đạt được độ nhạy chẩn đoán cao hơn
là việc sử dụng nhiều hơn một tập mồi để loại trừ các
kết quả âm tính giả gây ra bởi biến đổi gen.
Đây là một trong những lý do quan trọng tại sao chúng tôi đã lựa chọn
bộ mồi NCD7 / NCD8 ngoài NDC3 /
NCD4 (St Auber et al., 1995). Kết quả ban đầu của
thí nghiệm cũng đã chứng minh tính khả thi của RT-PCR cho chủng lentogenic như LaSota và
HitchnerB1. Trong các thử nghiệm ban đầu, phát hiện virus
trong mẫu mô từ đường hô hấp và
kết mạc là không đáng ngạc nhiên vì các
động vật bị nhiễm kết mạc-orall y. Trong các
thử nghiệm thời gian khóa học, như mong đợi, conjunctivas
của gà kết mạc-miệng tiêm đã
tích cực đầu tiên đã được tại ngày 1 và 2 pi Ngược lại,
các loài động vật tiếp xúc nhiễm cho thấy tích cực đầu tiên
phản ứng trong phổi, thận và amiđan manh tràng 3
ngày sau -exposure và không tích cực trong conjunctivas
trước ngày 6. Lý do cho RT-PCRnegative
proventriculus và ruột trong các động vật
bị giết tại ngày 4 và 5 pi (Bảng 1), mặc dù phân
mẫu dương tính cùng một lúc, có thể được
giải thích bởi thực tế rằng các mẫu phân là một
chất đồng trong chính nó và có thể được sử dụng cho các RNA
khai thác mà không cần xử lý thêm. Nó cũng là
có thể là bộ phận chỉ riêng biệt của đường ruột
chứa NDV tại một thời điểm nhất định, và do đó phân
mẫu cấy truyền thông qua toàn bộ ruột có thể
được làm giàu với số tiền cao của N