African Journal of Microbiology Res

African Journal of Microbiology Research Vol. 6(20), pp. 4256-4260, 30 May, 2012 Available online at http://www.academicjournals.org/AJMR
DOI: 10.5897/AJMR11.651
ISSN 1996-0808 ©2012 Academic Journals





Full Length Research Paper
Effect of Ultraviolet-C (UV-C) irradiation on the virulence genes expression in Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus
Rihab Lagha1#, Fethi Ben Abdallah1, 2*#, Ali Ellafi1, Héla Kallel2 and Amina Bakhrouf1
1Laboratoire d’Analyse, Traitement et Valorisation des Polluants de l’Environnement et des Produits, Faculté de Pharmacie Rue Avicenne. Monastir 5000, Tunisie.
2Unité de Fermentation et de Développement de Vaccins Virologiques, Institut Pasteur de Tunis.13 place Pasteur, 1002, Tunisie.

Accepted 27 December, 2011

In this study, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus, marine foodborne pathogens, were treated with Ultraviolet-C (UV-C) irradiation (240 J.m-2) to evaluate alterations in their virulence genes expression levels. Firstly, we searched for the presence of eight Vibrio cholerae virulence genes, toxR,
toxS, toxRS, ctxA, zot, ace, toxT, and virulence pathogenicity island (VPI), in the genome of investigated strains. The expression of toxR and toxS genes in UVC-irradiated bacteria, studied by reverse transcriptase polymerase chain reaction, was found to be altered. These variations were manifested by an increase or a decrease in the expression level of tested virulence genes. Further, the mRNA quantities of VPI and ace genes remained stable after treatment.

Key words: Vibrio, Ultraviolet-C (UV-C), alteration, virulence genes expression, RT-PCR.


INTRODUCTION


Ultraviolet-C (UV-C) radiation has been suggested as one of the successful disinfection practices for water treatment. Therefore, UV-sterilization has become a practical solution for safe disinfection of water (Said et al., 2010). The effectiveness of UV light in biological inacti- vation arises primarily from the fact that Deoxyribonucleic acid (DNA) molecules absorb UV photons between 200 and 300 nm, with peak absorption at 254 nm (Jeffrey et al., 1990). This absorption creates damage in the DNA by altering the nucleotide base pairing, thereby creating new linkages between adjacent nucleotides on the same DNA strand. This damage occurs particularly between pyrimidine bases. Two types of mutagenic lesions in DNA were determined: cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) formed between the C-4 and C-5 positions of adjacent




*Corresponding author. E-mail: [e-mail]. Tel: + 21 6 73 466 244. Fax: + 216 73 461 830.

# These authors have equally contributed to this work

thymidine or cytosine residues, and pyrimidine (6 to 4) pyrimidone (6 to 4) photoproducts formed between the C6 and C4 position of adjacent pyrimidine residues, most often between T-C and C-C residues (Zimmer and Slawson, 2002). UV radiation in the range of 250 to 260 nm is lethal to most micro-organisms, including bacteria, viruses, protozoa, mycelial fungi, yeasts and algae. Among the bacteria, V. alginolyticus and V. parahaemolyticus, marine foodborne pathogen, frequently involved in epizootic outbreaks in cultured gilt- head sea bream and sea bass, causing fish mortality in Tunisian aquaculture farms (Abdallah et al., 2009a). In marine environment, V. alginolyticus and V. parahaemolyticus were considered as an important reservoir of Vibrio cholerae virulence genes (Abdallah et al., 2009b). According to Boyd et al. (2000) these genes may be horizontally transferred to V. alginolyticus in an aquatic environment. Indeed, the mobility of virulence genes may cause the transformation of non pathogenic strain to pathogenic strain. Xie et al. (2005) reported that
V. alginolyticus often possess homologues of the V. parahaemolyticus and V. cholerae virulence genes such





Abdallah et al. 4257




as toxR, tlh and VPI, suggesting that V. alginolyticus may be an important reservoir of many known virulence genes of other Vibrio species in the aquatic environment. It is probably that the aquatic environment harbours different virulence-associated genes scattered among environmental Vibrios.
In this work we searched, by polymerase chain reaction (PCR), for the presence of eight V. cholerae virulence genes, toxR, toxS, toxRS, ctxA, zot, ace, toxT, and virulence pathogenicity island (VPI), in the genome of V. alginolyticus and V. parahaemolyticus strains. The expression level of transferred virulence genes under UVC irradiation was achieved by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).


MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains

Six Vibrio strains were used in this study including three reference strains: V. alginolyticus ATCC 33787 (S1), V. alginolyticus ATCC 17749 (S2), and V. parahaemolyticus ATCC 17802 (S5). In addition, V. parahaemolyticus strain (S6), isolated from the Calich estuary (Alghero, Italy), and two V. alginolyticus strains (S3 and S4) isolated, respectively from the internal organs of aquacultured diseased gilthead sea bream (Sparus aurata) and sea bass (Dicentrarchus labrax), in Tunisian aquaculture farm (Abdallah et al., 2009a), were included in this work.


UVC treatment

V. alginolyticus and V. parahaemolyticus were cultivated at 30°C in Tryptic soy broth 1% NaCl (TSB 1%) with shaking (150 rpm). The cultures of Vibrio strains grown to late log phase (OD600 = 0.6) were diluted and spread on Tryptic soy 1% NaCl (TSA 1%, Pronadisa, Spain) agar plates in glass Petri dishes. After 18 h of incubation at 30°C, bacterial colonies that appeared on the plates were exposed, in triplicate, to UV light according to the method described previously (Wang et al., 2004). The plates with even bacterial growth were covered with a piece of glass for non-UV treatment. The plates (covered and non-covered) were exposed to a 4-W UV lamp with a wavelength of 254 nm. The applied dose was 240
Joules m-2. After exposure, 250-ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of TSB 1% were inoculated with a loopful of colonies from
control and UV treated bacteria. All flasks were kept in at 30°C for 18 h with a shaking.



PCR detection of Vibrio cholerae virulence genes in V. alginolyticus and V. parahaemolyticus strains

Bacteria were cultured on TSA 1% for 24 h at 30°C. One colony was cultured in TSB 1% for 24 h at 30°C, and 1.5 mL was cen- trifuged. DNA was extracted using a Wizard genomic purification kit (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer’s instructions. The primers of V. cholerae virulence genes used in this study (Sechi et al., 2000) are listed in Table 1. Polymerase chain reaction (PCR) were performed in 25 µL containing 50 ng of extracted DNA, 5 µL Green Go Taq buffer (5×), 0.25 µL of each deoxynucleoside triphosphate (10 mM), 0.5 µL MgCl2 (50 mM), 1
µL of each primer (25 pM), and 1U of Go Taq DNA polymerase
(Promega). Reaction mixtures were incubated for 5 min at 94°C; followed by 35 cycles at 94°C for 45 s; annealing at 52°C for 45 s

for toxS, toxR, and virulence pathogenicity island (VPI); 72°C for 1 min; and a final extension at 72°C for 10 min. The annealing temperature for the detection of the toxRS and toxT genes was 58°C, whereas for ctxA, ace, and zot the temperature was 60°C. PCR products (5 µL) were analyzed on 1% agarose gels stained with ethidium bromide (0.5 mg/mL) at 90 V for 1 h and viewed under ultraviolet transillumination. All PCR-positive strains, indicating the presence of the virulence genes, were confirmed by repeating the PCR three times.


RT-PCR for virulence gene expression

To study the level of expression of V. alginolyticus and V. parahaemolyticus virulence genes before and after UV irradiation, semi-quantitative RT-PCR method was used. RNA from control and irradiated cells was extracted by SV total RNA isolation system (Promega) according to the manufacturer’s instructions. RNA was quantified by Ultraspec spectrophotometer (Ultraspec 2100 pro; Amersham Biosciences Europe GmbH, France). RT-PCR was
performed in triplicate using SuperScriptTM One-Step RT-PCR with
Platinum® Taq kit according to the manufacturer’s recom- mendations (Invitrogen, Carlsbad, CA). For cDNA synthesis, 100 ng of RNA served as template. RT-PCR (25 µL reaction volume) was
performed as follows: 50°C for 30 min; 94°C for 2 min; 35 cycles at 94°C for 45 s; annealing at 52°C for 45 s for toxS, toxR, and VPI; 72°C for 1 min; and a final extension at 72°C for 10 min. The annealing temperature for ace gene was 60°C. RT-PCR products (5
µL) were analyzed on 1% agarose gel stained with ethidium bromide (0.5 mg/mL) at 90 V for 1 h and viewed under ultraviolet transillumination. The amplification products were photographed and their sizes determined with 100 bp molecular size marker (Promega). Quantitative analysis of DNA bands was performed using imaging software (Gene Tools, Sygene, UK).



RESULTS

Virulence genes expression

PCR amplification of the eight V. cholerae virulence genes in investigated Vibrio strains showed that only V. alginolyticus (S1 and S3) and V. parahaemolyticus (S5 and S6) were positive for toxR and toxS genes. In addition, V. alginolyticus S3 and S4 were positive for VPI and ace genes, respectively.
Expression levels of detected genes before and after treatments with UVC irradiation were analyzed by semi- quantitative RT-PCR (Figure 1). After treatment, we observed a decrease in the expression level of toxS gene in V. parahaemolyticus (S6) isolated from the Calich estuary. In addition, the expression level of toxR gene was decreased in V. parahaemolyticus S6 but it was increased in V. alginolyticus S3. Further, the mRNA quantities of VPI and ace genes remained stable in V. alginolyticus strains S3 and S4, respectively.


DISCUSSION

The results developed in this work indicate wide dissemination among V. alginolyticus and V. parahaemolyticus of different V. cholerae virulence genes





4258 Afr. J. Microbiol. Res.



Table 1. PCR primers sele

Kết quả (Việt) 1:

Tạp chí Châu Phi của vi sinh vật học nghiên cứu tập 6(20), pp. 4256-4260, 30 tháng năm, năm 2012 có sẵn trực tuyến tại http://www.academicjournals.org/AJMRDOI: 10.5897/AJMR11.651ISSN 1996-0808 © 2012 học tạp chíChiều dài đầy đủ nghiên cứu giấyTác dụng của bức xạ tia cực tím-C (UV-C) trên biểu hiện gen virulence ở Vibrio parahaemolyticus và Vibrio alginolyticusRihab Lagha1 #, Fethi Ben Abdallah1, 2 * #, Ali Ellafi1, Héla Kallel2 và Amina Bakhrouf11Laboratoire d'Analyse, Traitement et Valorisation des Polluants de l'Environnement et des Produits, Faculté de Pharmacie Rue Avicenne. Monastir 5000, Tunisie.2Unité de lên men et de Développement de Vaccins Virologiques, Institut Pasteur de Tunis.13 đặt Pasteur, 1002, Tunisie.Được chấp nhận ngày 27, 2011Trong nghiên cứu, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio alginolyticus, biển thực phẩm tác nhân gây bệnh, đã được điều trị bằng bức xạ tia cực tím-C (UV-C) (240 J.m-2) để đánh giá các thay đổi trong mức độ biểu hiện gen virulence của họ. Trước hết, chúng tôi tìm kiếm sự hiện diện của tám Vibrio cholerae virulence gen, toxR,toxS, toxRS, ctxA, zot, ace, toxT, và virulence bài đảo (VPI), trong bộ gen của tra chủng. Sự biểu hiện của gen toxR và toxS trong vi khuẩn UVC chiếu xạ, nghiên cứu phản ứng chuỗi trùng hợp ngược, đã được tìm thấy được thay đổi. Những biến thể này được thể hiện bởi tăng hoặc giảm mức độ biểu hiện của gen thử nghiệm virulence. Hơn nữa, số lượng mRNA VPI và ace gen vẫn ổn định sau khi điều trị.Từ khóa: Vibrio, tia cực tím-C (UV-C), thay đổi, biểu hiện gen virulence, RT-Đảng Cộng sản Romania.GIỚI THIỆU Bức xạ tia cực tím-C (UV-C) đã được đề xuất là một trong những cách thức thành công khử trùng để xử lý nước. Vì vậy, UV-khử trùng đã trở thành một giải pháp thực tế cho an toàn khử trùng nước (Said và ctv., 2010). Hiệu quả của UV ánh sáng trong sinh học inacti-vation phát sinh chủ yếu từ thực tế rằng Deoxyribonucleic acid (DNA) phân tử hấp thụ tia UV photon giữa 200 và 300 nm, với đỉnh hấp thụ tại 254 nm (Jeffrey và ctv., 1990). Hấp thu này tạo ra thiệt hại trong DNA bằng cách thay đổi các nucleotide cơ sở ghép nối, do đó việc tạo ra mối liên kết mới giữa liền kề nucleotide trên chuỗi ADN cùng. Thiệt hại này xảy ra đặc biệt là giữa pyrimidine căn cứ. Hai loại mutagenic tổn thương trong DNA đã được xác định: cyclobutan pyrimidine dimer (CPD) hình thành giữa các vị trí C-4 và C-5 của liền kề * Tác giả tương ứng. E-mail: [e-mail]. Điện thoại: + 21 6 73 466 244. Số Fax: + 216 73 461 830.# Các tác giả đã đều góp phần vào công việc này thymidine hoặc cytosine dư lượng và pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4) photoproducts được thành lập giữa vị trí C6 và C4 của dư lượng liền kề pyrimidine, thường xuyên nhất giữa dư lượng T-C và C-C (Zimmer và Slawson, 2002). Tia cực tím trong khoảng 250 đến 260 nm là nguy hiểm để hầu hết vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn, vi rút, động vật nguyên sinh, mycelial nấm, nấm men và tảo. Trong số các vi khuẩn, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus, mầm bệnh thực phẩm biển, thường xuyên tham gia vào epizootic dịch trong văn hóa gilt đầu biển bream và biển bass, gây ra tỷ lệ tử vong cá ở trang trại nuôi trồng thủy sản Tunisia (Abdallah và ctv., 2009a). Trong môi trường biển, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus được coi là một hồ chứa nước quan trọng của Vibrio cholerae virulence gen (Abdallah và ctv., 2009b). Theo Boyd et al. (2000) những gen có thể được theo chiều ngang chuyển sang V. alginolyticus trong một môi trường thuỷ sản. Thật vậy, tính di động của virulence gen có thể gây ra sự chuyển đổi của gây bệnh không căng thẳng đến căng thẳng gây bệnh. Xie et al. (2005) báo cáo rằngV. alginolyticus thường có lớn của V. parahaemolyticus và V. cholerae virulence gen như vậy Abdallah et al. 4257 như toxR, tlh và VPI, gợi ý rằng V. alginolyticus có thể là một hồ chứa nước quan trọng của nhiều được biết đến virulence gen của loài Vibrio khác trong môi trường thuỷ sản. Nó có lẽ là môi trường thuỷ sản cảng khác nhau liên quan đến virulence gen rải rác giữa các môi trường Vibrios.Trong công việc này chúng tôi tìm kiếm, bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR), sự hiện diện của tám V. cholerae virulence gen, toxR, toxS, toxRS, ctxA, zot, ace, toxT, và virulence bài đảo (VPI), trong bộ gen của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus chủng. Mức độ biểu hiện của virulence chuyển gen dưới chiếu xạ UVC đạt được bằng phản ứng chuỗi trùng hợp ngược (RT-Đảng Cộng sản Romania).VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPCác chủng vi khuẩnSáu Vibrio chủng đã được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm ba tham khảo chủng: V. alginolyticus ATCC 33787 (S1), V. alginolyticus ATCC 17749 (S2) và V. parahaemolyticus ATCC 17802 (S5). Ngoài ra, V. parahaemolyticus căng thẳng (S6), bị cô lập từ cửa sông Calich (Alghero, ý), và hai V. alginolyticus chủng (S3 và S4) bị cô lập, tương ứng từ các cơ quan nội tạng của cá vền biển aquacultured bệnh gilthead (Sparus aurata) và biển bass (Dicentrarchus labrax), tại trang trại nuôi trồng thủy sản Tunisia (Abdallah et al., 2009a), đã được bao gồm trong công việc này.Điều trị UVCV. alginolyticus và V. parahaemolyticus được trồng ở 30° C trong Tryptic đậu nành canh 1% NaCl (TSB 1%) với lắc (150 vòng/phút). Các nền văn hóa của Vibrio chủng phát triển đến cuối đăng nhập giai đoạn (OD600 = 0,6) đã được pha loãng và lây lan trên Tryptic đậu nành 1% NaCl (TSA 1%, Pronadisa, Tây Ban Nha) agar tấm kính Petri món ăn. Sau khi 18 h ấp ở 30° C, vi khuẩn thuộc địa xuất hiện trên các tấm đã tiếp xúc, trong triplicate, để UV ánh sáng theo phương pháp mô tả trước đó (Wang et al, 2004). Tấm với thậm chí vi khuẩn phát triển đã được bảo hiểm với một mảnh thủy tinh cho điều trị UV. Tấm (được bảo hiểm và không được bảo hiểm) đã tiếp xúc với một đèn UV 4-W với bước sóng của 254 nm. Ứng dụng liều là 240Joules m-2. Sau khi tiếp xúc, 250 ml Erlenmeyer bình chứa 100 ml TSB 1% đã được tiêm chủng với một loopful thuộc địa từkiểm soát và UV điều trị vi khuẩn. Tất cả bình bị giữ ở lúc-30° C cho 18 h với lắc một.Đảng Cộng sản Romania phát hiện của Vibrio cholerae virulence gen trong V. alginolyticus và V. parahaemolyticus chủngVi khuẩn được nuôi cấy trên TSA 1% cho 24 h 30° C. Một thuộc địa được nuôi cấy trong TSB 1% cho 24 h 30° C, và 1.5 mL là cen-trifuged. DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng một gen làm sạch kit Wizard (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lớp lót của V. cholerae virulence gen được sử dụng trong nghiên cứu này (Sechi và ctv., 2000) được liệt kê trong bảng 1. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã được thực hiện trong 25 ML có chứa 50 của chiết xuất DNA, 5 ml xanh đi Taq đệm (5 ×), 0,25 ml mỗi deoxynucleoside triphosphate (10 mM), cách 0.5 ml MgCl2 (50 mM), 1Ml của mỗi mồi (25 pM), và 1U đi Taq DNA polymerase(Promega). Phản ứng hỗn hợp đã được ủ trong 5 phút tại 94° C; tiếp nối bởi 35 chu kỳ tại 94° C cho 45 s; làm cho deo tại 52° C cho 45 s cho toxS, toxR, và virulence bài đảo (VPI); 72° C cho 1 phút; và một phần mở rộng cuối cùng tại 72° C trong 10 phút. Nhiệt độ tôi để phát hiện các gen toxRS và toxT là 58° C, trong khi đối với ctxA, ace, và zot nhiệt độ là 60° C. Đảng Cộng sản Romania sản phẩm (5 ml) được phân tích trên 1% agarose gel nhuộm màu với ethidium bromua (0,5 mg/mL) tại 90 V cho 1 h và xem dưới tia cực tím transillumination. Tất cả các chủng PCR-tích cực, chỉ ra sự hiện diện của các gen virulence, đã được xác nhận bằng cách lặp lại Đảng Cộng sản Romania ba lần.RT-PCR Addon biểu hiện gen virulenceĐể nghiên cứu mức độ biểu hiện của V. alginolyticus và V. parahaemolyticus virulence gen trước và sau khi bức xạ UV, bán định lượng RT-PCR phương pháp được sử dụng. RNA từ kiểm soát và chiếu xạ tế bào được chiết xuất bởi SV tất cả RNA cô lập hệ thống (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được định lượng bởi Ultraspec phối (Ultraspec 2100 chuyên nghiệp; Amersham Biosciences Europe GmbH, Pháp). RT-PCR làthực hiện trong triplicate bằng cách sử dụng SuperScriptTM One-Bước RT-PCR vớiBạch kim ® Taq bộ theo các nhà sản xuất recom-mendations (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cho tổng hợp cDNA, 100 của RNA làm mẫu. Đảng Cộng sản Romania RT (khối lượng phản ứng 25 ml) làthực hiện như sau: 50° C trong 30 phút; 94° C cho 2 phút; 35 chu kỳ tại 94° C cho 45 s; làm cho deo tại 52° C cho 45 s cho toxS, toxR, và VPI; 72° C cho 1 phút; và một phần mở rộng cuối cùng tại 72° C trong 10 phút. Nhiệt độ tôi cho ace gen là 60° C. Đảng Cộng sản Romania RT sản phẩm (5Ml) được phân tích trên 1% agarose gel nhuộm màu với ethidium bromua (0,5 mg/mL) tại 90 V cho 1 h và xem dưới tia cực tím transillumination. Các sản phẩm khuếch đại được chụp ảnh và kích thước xác định với 100 bp kích thước phân tử đánh dấu (Promega). Phân tích định lượng của DNA ban nhạc được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm hình ảnh (gen công cụ, Sygene, Vương Quốc Anh).KẾT QUẢVirulence gen biểu hiệnĐảng Cộng sản Romania các khuếch đại của tám V. cholerae virulence gen trong tra Vibrio chủng cho thấy rằng chỉ V. alginolyticus (S1 và S3) và V. parahaemolyticus (S5 và S6) đã tích cực cho toxR và toxS gen. Ngoài ra, V. alginolyticus S3, và S4 là tích cực cho VPI và ace gen, tương ứng.Mức độ biểu hiện của gen được phát hiện trước khi và sau khi điều trị với UVC chiếu xạ đã được phân tích bán định lượng RT-Đảng Cộng sản Romania (hình 1). Sau khi điều trị, chúng tôi quan sát thấy một sự giảm xuống trong mức độ biểu hiện của toxS gen trong V. parahaemolyticus (S6) bị cô lập từ cửa sông Calich. Ngoài ra, mức độ biểu hiện của gen toxR được giảm trong V. parahaemolyticus S6 nhưng nó đã được tăng lên trong V. alginolyticus S3. Hơn nữa, số lượng mRNA VPI và ace gen vẫn ổn định ở V. alginolyticus chủng S3, và S4, tương ứng.THẢO LUẬNKết quả phát triển trong công việc này cho thấy nhiều phổ biến trong số V. alginolyticus và V. parahaemolyticus khác nhau V. cholerae virulence gen 4258 Afr. J. Microbiol. Res.Bảng 1. Đảng Cộng sản Romania chất nền, mồi sele