Pronuclear DNA microinjectionThe fi

Pronuclear DNA microinjection
The first technique successfully used to produce transgenic pigs was DNA microinjection into pronuclei of zygotes [13, 14]. Generally, the efficiency of DNA microinjection is low. In addition, pronuclear DNA microinjection suffers from the fact that it may yield founder animals that are
654 J Mol Med (2010) 88:653–664
mosaic, and that random integration of the injected DNA fragments may cause varying expression levels due to position effects of the neighboring DNA or may disrupt functional endogenous sequences (insertional mutagenesis; reviewed in [4]). In spite of the overall low efficiency, probably most of the transgenic pig lines existing so far have been established by the pronuclear microinjection technique.
Sperm-mediated gene transfer
SMGT is based on the intrinsic ability of sperm to bind and internalize exogenous DNA and to transfer it into the egg during fertilization (reviewed in [15]). Although the efficiency of SMGT was discussed controversially after its first description in the mouse, SMGT in the pig was achieved by collection of sperm, incubation of sperm with exogenous DNA, and artificial insemination of gilts with DNA-loaded sperm. An important factor for the success of this method seems to be the selection of suitable sperm donor animals [16]. Linker-based sperm-mediated gene transfer is a variant of the procedure where the uptake of exogenous DNA by sperm cells is improved by receptormediated endocytosis of DNA–antibody complexes [17]. Another modification of SMGT is intracytoplasmic sperm injection-mediated gene transfer. The first step is the induction of sperm membrane damage (e.g., by freezethawing), followed by incubation with exogenous DNA, and finally intracytoplasmic injection of sperm with bound DNA into oocytes [18].
Lentiviral gene transfer
Lentiviruses belong to the family Retroviridae and transfer their RNA genome into infected cells, where it is reverse transcribed to DNA and integrated into the host genome as a so-called provirus which is transmitted in Mendelian manner to the offspring. Lentiviruses can transduce nondividing cells which allows immediate integration of the vector genome into the early embryo, reducing the risk of mosaic formation [19]. Lentiviral gene transfer was adapted to pigs [20, 21] and resulted in high proportions of transgenic offspring. Although lentiviral vector systems can only carry

Kết quả (Việt) 1:

Pronuclear DNA microinjectionThe first technique successfully used to produce transgenic pigs was DNA microinjection into pronuclei of zygotes [13, 14]. Generally, the efficiency of DNA microinjection is low. In addition, pronuclear DNA microinjection suffers from the fact that it may yield founder animals that are654 J Mol Med (2010) 88:653–664mosaic, and that random integration of the injected DNA fragments may cause varying expression levels due to position effects of the neighboring DNA or may disrupt functional endogenous sequences (insertional mutagenesis; reviewed in [4]). In spite of the overall low efficiency, probably most of the transgenic pig lines existing so far have been established by the pronuclear microinjection technique.Sperm-mediated gene transferSMGT is based on the intrinsic ability of sperm to bind and internalize exogenous DNA and to transfer it into the egg during fertilization (reviewed in [15]). Although the efficiency of SMGT was discussed controversially after its first description in the mouse, SMGT in the pig was achieved by collection of sperm, incubation of sperm with exogenous DNA, and artificial insemination of gilts with DNA-loaded sperm. An important factor for the success of this method seems to be the selection of suitable sperm donor animals [16]. Linker-based sperm-mediated gene transfer is a variant of the procedure where the uptake of exogenous DNA by sperm cells is improved by receptormediated endocytosis of DNA–antibody complexes [17]. Another modification of SMGT is intracytoplasmic sperm injection-mediated gene transfer. The first step is the induction of sperm membrane damage (e.g., by freezethawing), followed by incubation with exogenous DNA, and finally intracytoplasmic injection of sperm with bound DNA into oocytes [18].Lentiviral gene transferLentiviruses belong to the family Retroviridae and transfer their RNA genome into infected cells, where it is reverse transcribed to DNA and integrated into the host genome as a so-called provirus which is transmitted in Mendelian manner to the offspring. Lentiviruses can transduce nondividing cells which allows immediate integration of the vector genome into the early embryo, reducing the risk of mosaic formation [19]. Lentiviral gene transfer was adapted to pigs [20, 21] and resulted in high proportions of transgenic offspring. Although lentiviral vector systems can only carry <10 kb exogenous DNA, this is considered to be enough for transfer of expression vectors for cDNAs and small interfering RNAs. As prokaryotic vector sequences are often subject to epigenetic silencing by DNA methylation, it was important to investigate this phenomenon in transgenic pigs harboring lentiviral integrants. Our studies revealed that—after segregation to the G1 generation—one third of lentiviral integrants exhibited low expression levels and hypermethylation [22], whereas two thirds of the lentiviral integrants were expressed faithfully through subsequent generations. Thus, lentiviral transgenesis is clearly an attractive alternative to the pronuclear microinjection technique.Somatic cell nuclear transferSince successful SCNT protocols are available for the pig [23–25], this technology is an attractive route for geneticFig. 1 Current techniques for the genetic modification of pigs include DNA microinjection into the pronuclei of fertilized oocytes (DNA-MI), spermmediated gene transfer (SMGT), lentiviral transgenesis (LV-GT), and somatic cell nuclear transfer using genetically modified nuclear donor cells (SCNT). LV-GT can be performed by subzonal injection of viral particles into oocytes before or after fertilization. A modification of SMGT is intracytoplasmic injection (ICSI) of frozen-thawed sperm after incubation with DNA (see text for further details)J Mol Med (2010) 88:653–664 655modification of this species. In general, transgenesis by SCNT involves the following steps: (1) genetic modification and selection of donor cells in culture; (2) recovery and enucleation of in vivo or in vitro matured oocytes (metaphase II); (3) nuclear transfer by electrofusion or piezo-actuated microinjection (less common) and activation; (4) in vitro culture of the reconstructed embryos; and (5) embryo transfer to synchronized recipients. Various modifications like “handmade cloning” were developed to simplify SCNT in pigs [26]. SCNT is so far the only route to introduce targeted mutations into the pig genome. Via homologous recombination in nuclear donor cells, mutations have been introduced in the alpha-1,3-galactosyltransferase (GGTA1) and the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) genes, and live offspring have been born following SCNT using these cells [27, 28]. Other attractive characteristics comprise: no generation of mosaic phenotypes and the possibility of pre-selection of donor cells with regard to transgene expression or gender. Furthermore, SCNT from genetically modified pools of donor cells followed by selection of suitable donor fetuses or offspring can be used to speed up transgenesis in the pig (Fig. 2). The efficiency of cloning in pig is still relatively low, ranging between 0.5% and 5% offspring per transferred SCNT embryos. As in other species the low efficiency of SCNT is attributed to failures in epigenetic reprogramming (reviewed in [29]).Transgenic pigs as models for human diseases
Compared to laboratory rodents, experimental standardization of large animal models is low, and cost and labor are high. Therefore, transgenic pig models have been primarily developed for important disease areas where translational research in the available rodent models is limited by their small size and short life span or where rodent models do not adequately reflect the respective disease phenotypes. A summary of published transgenic pig models is provided in Table 1. Referring to the genes described in Table 1, protein data of amyloid precursor protein (APP), huntingtin (HTT), rhodopsin (RHO), endothelial cell nitric oxide synthase (eNOS), CFTR, and hepatocyte nuclear factor 1 alpha (HNF1A) are available for human, pig, and mouse (http:// www.uniprot.org; http://www.ensembl.org). Species comparison of orthologous proteins was done by alignment and manual adaptation of the amino acid sequences in BioEdit [30]. For APP, RHO, eNOS, CFTR, and HNF1A, the human proteins are more similar to the pig orthologs. For HTT, the human protein is more similar to the mouse ortholog. However, analysis of the repeat number of intragenic trinucleotide repeats associated with inherited
human neurodegenerative diseases showed that the trinucleotide repeat regions are more conserved in terms of repeat length between humans and pigs than between humans and rodents [31].
Neurodegenerative diseases
Alzheimer’s disease is a multifactorial neural disease and occurs in some families as an autosomal dominant disorder showing the onset of the disease after 40 years. Causative mutations were identified in the amyloid precursor protein gene (APP) leading to the increased production of distinct protein fragments which in turn results in neuropathy. To develop a pig model for Alzheimer’s disease, transgenic pigs were produced using the human dominant mutant allele APPsw harboring two amino acid exchanges due to two neighboring nucleotide exchanges which was found to cause Alzheimer’s disease. According to previous transgenic mouse studies, a 7.5 kb transgene was constructed with a 1-kb platelet-derived growth factor-beta promoter, intronic and exonic sequences of the beta-globin gene, the cDNA encoding the mutant allele APPsw, and SV40 polyadenylation sequences. After stable genetic modification of fibroblasts of the Göttingen minipig breed, one transgenic cell clone was used for SCNT to produce seven healthy transgenic cloned pigs with normal weight gain. The transgenic pigs harbored a single full-length copy of the transgene in their genome and showed strong, promoterspecific expression of the transgenic protein in brain tissues. Accumulation of the pathogenic protein and subsequent appearance of clinical consequences were estimated to develop with increasing age [32]. Huntington’s disease is an autosomal dominant, progressive neurodegenerative disorder involving the premature loss of specific neurons. It is associated with an expansion of a CAG trinucleotide repeat in the 5′ region of the huntingtin gene (HTT) which results in a lengthened polyglutamine tract of the protein. The CAG repeat number is polymorphic, ranging from 6 to 35 units in normal alleles and from 36 to 120 units in alleles associated with Huntington’s disease. The 12.8-kb HTT transcript of Göttingen minipigs codes for a 345-kDa protein (3,139 amino acids) [33]. The 8.2-kb transgene used for DNA microinjection into minipig embryos consisted of the 4-kb rat neuronspecific enolase (Nse) promoter, a 3.3-kb 5 ′ minipig huntingtin cDNA which was mutated by insertion of 75 CAG repeats into the triplet region of exon 1, and a 0.9-kb SV40 polyadenylation signal. Five transgenic founder pigs were produced each harboring one to three different integration sites with variable copy numbers and indication of genetic mosaicism

Kết quả (Việt) 2:

Pronuclear vi tiêm DNA
Kỹ thuật đầu tiên sử dụng thành công để sản xuất lợn biến đổi gen là DNA vi tiêm vào pronuclei của hợp tử [13, 14]. Nói chung, hiệu quả của DNA vi tiêm là thấp. Ngoài ra, pronuclear vi tiêm DNA bị từ thực tế là nó có thể mang lại động vật sáng lập mà là
654 J Mol Med (2010) 88: 653-664
khảm, và tích hợp ngẫu nhiên của các đoạn DNA tiêm có thể gây ra mức độ biểu hiện do tác dụng vị trí khác nhau của DNA lân cận hoặc có thể làm gián đoạn chuỗi nội sinh chức năng (đột biến ghép; xem xét trong [4]). Mặc dù hiệu quả thấp tổng thể, có lẽ hầu hết các dòng lợn biến đổi gen hiện có cho đến nay đã được thành lập bởi các kỹ thuật vi tiêm pronuclear.
Tinh trùng trung gian chuyển gen
SMGT là dựa vào khả năng nội tại của tinh trùng để ràng buộc và nội hóa DNA ngoại sinh và chuyển giao nó vào trứng trong quá trình thụ (xem xét trong [15]). Mặc dù hiệu quả của SMGT đã được thảo luận tranh cãi sau khi mô tả đầu tiên của mình ở chuột, SMGT ở lợn đã đạt được bằng bộ sưu tập của tinh trùng, ủ bệnh của tinh trùng với DNA ngoại sinh, và thụ tinh nhân tạo với tinh trùng của lợn cái DNA-nạp. Một yếu tố quan trọng cho sự thành công của phương pháp này có vẻ là sự lựa chọn của con vật hiến tặng tinh trùng thích hợp [16]. Linker dựa trên chuyển gen tinh trùng qua trung gian là một biến thể của thủ tục mà sự hấp thu của DNA ngoại sinh bởi các tế bào tinh trùng được cải thiện bởi endocytosis receptormediated của khu phức hợp DNA-kháng thể [17]. Một sửa đổi SMGT là tinh trùng vào bào tiêm qua trung gian chuyển gen. Bước đầu tiên là sự cảm ứng của tinh trùng màng thiệt hại (ví dụ, bằng freezethawing), tiếp theo là ủ với DNA ngoại sinh, và tiêm cuối cùng vào bào của tinh trùng với DNA bị ràng buộc vào tế bào trứng [18].
Chuyển gen lentivirus
Lentivirus thuộc Retroviridae gia đình và chuyển giao RNA hệ gen của mình vào các tế bào bị nhiễm, nơi nó được đảo ngược chép DNA và tích hợp vào hệ gen vật chủ như một provirus cái gọi là được truyền theo cách Mendel cho con cái. Lentivirus có thể tải nạp các tế bào không phân chia cho phép tích hợp trực tiếp của bộ gen vector vào phôi ban đầu, làm giảm nguy cơ hình thành khảm [19]. Chuyển gen lentivirus đã được chuyển thể sang lợn [20, 21] và kết quả là tỷ lệ cao của con biến đổi gen. Mặc dù hệ thống vector lentivirus chỉ có thể mang <10 kb DNA ngoại sinh, điều này được coi là đủ để chuyển các vector biểu hiện cho cDNA và ARN gây nhiễu. Như trình tự vector prokaryote thường phải tuân theo sự im lặng biểu sinh bởi sự methyl hóa DNA, điều quan trọng là để điều tra hiện tượng này ở lợn chuyển gen chứa chấp integrants lentivirus. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng, sau khi chia tách vào G1 thế hệ-một phần ba integrants lentivirus trưng bày mức độ biểu hiện thấp và hypermethylation [22], trong khi hai phần ba số integrants lentivirus đã bày tỏ sự trung thành qua nhiều thế hệ tiếp theo. Như vậy, transgenesis lentivirus rõ ràng là một lựa chọn hấp dẫn đối với kỹ thuật vi tiêm pronuclear.
Soma di chuyển nhân
Kể từ giao thức SCNT thành công có sẵn cho các con lợn [23-25], công nghệ này là một con đường hấp dẫn cho di truyền
hình. 1 kỹ thuật hiện tại cho các biến đổi gen của lợn bao gồm DNA vi tiêm vào pronuclei của tế bào trứng đã thụ tinh (DNA-MI), chuyển gen spermmediated (SMGT), lentivirus transgenesis (LV-GT), và tế bào soma chuyển nhân sử dụng tế bào hiến tặng hạt nhân biến đổi gen (SCNT). LV-GT có thể được thực hiện bằng cách tiêm subzonal của các hạt virus vào tế bào trứng trước hoặc sau khi thụ tinh. Một sự thay đổi của SMGT là tiêm vào bào (ICSI) của tinh trùng đông lạnh-giải đông sau khi ủ với DNA (xem văn bản để biết thêm chi tiết)
J Mol Med (2010) 88: 653-664 655
sửa đổi của các loài này. Nói chung, transgenesis bởi SCNT bao gồm các bước sau đây: (1) biến đổi gen và lựa chọn của các tế bào trong nền văn hóa của nhà tài trợ; (2) Thu hồi và trích xuất ra trong cơ thể hoặc trong ống nghiệm trưởng thành tế bào trứng (metaphase II); (3) chuyển nhân bởi electrofusion hoặc Piezo-actuated vi tiêm (ít gặp) và kích hoạt; (4) Nuôi cấy in vitro của phôi tái tạo; và (5) chuyển phôi đến người nhận đồng bộ. Sửa đổi khác nhau như "nhân bản thủ công" đã được phát triển để đơn giản hóa SCNT ở lợn [26]. SCNT là cho đến nay con đường duy nhất để giới thiệu các đột biến nhắm mục tiêu vào hệ gen của lợn. Qua tái tổ hợp tương đồng ở tế bào hạt nhân của nhà tài trợ, các đột biến đã được giới thiệu trong các alpha-1,3-galactosyltransferase (GGTA1) và xơ nang điều hành độ dẫn (CFTR) gen, con cháu sống cũng đã được sinh ra SCNT sau đây sử dụng các tế bào [27, 28]. Đặc điểm hấp dẫn khác bao gồm: không có thế hệ các kiểu hình khảm và các khả năng lựa chọn trước các tế bào của nhà tài trợ liên quan đến biểu hiện gen chuyển hoặc giới tính với. Hơn nữa, SCNT từ hồ biến đổi gen của tế bào các nhà tài trợ tiếp theo là lựa chọn của bào thai của nhà tài trợ phù hợp hoặc con cái có thể được sử dụng để tăng tốc độ transgenesis ở lợn (Fig. 2). Hiệu quả của việc nhân bản vô tính ở lợn vẫn còn tương đối thấp, dao động từ 0,5% đến 5% con mỗi phôi SCNT chuyển. Như ở các loài khác hiệu quả thấp của SCNT là do thất bại trong việc tái lập trình biểu sinh (xem xét trong [29]).
Lợn chuyển gen như các mô hình cho bệnh nhân
So với các loài gặm nhấm trong phòng thí nghiệm, tiêu chuẩn thử nghiệm của mô hình động vật lớn là thấp, và chi phí và lao động được cao. Do đó, các mô hình chăn nuôi lợn biến đổi gen đã được phát triển chủ yếu cho các khu vực bệnh quan trọng, nơi nghiên cứu chuyển dịch trong các mô hình động vật gặm nhấm có sẵn được giới hạn bởi kích thước nhỏ và tuổi thọ ngắn hoặc nơi mô hình động vật gặm nhấm không phản ánh đầy đủ các kiểu hình bệnh tương ứng. Một bản tóm tắt của các mô hình chăn nuôi lợn biến đổi gen xuất bản được cung cấp trong bảng 1. Đề cập đến các gen được mô tả trong Bảng 1, dữ liệu protein của protein amyloid tiền thân (APP), huntingtin (HTT), Rhodopsin (RHO), màng tế bào nitric oxide synthase (Enos) , CFTR, và tế bào gan hạt nhân tố 1 alpha (HNF1A) có sẵn cho con người, lợn và chuột (http: // www.uniprot.org; http://www.ensembl.org). Loài so sánh các protein orthologous đã được thực hiện bởi sự liên kết và thích ứng của nhãn hiệu của các trình tự axit amin trong BioEdit [30]. Đối với APP, RHO, Enos, CFTR, và HNF1A, các protein của con người là giống như những orthologs lợn. Đối với HTT, các protein của con người là giống như những ortholog chuột. Tuy nhiên, phân tích của các số lặp lại lặp đi lặp lại ba nucleotide intragenic liên quan với di truyền
các bệnh thoái hóa thần kinh của con người cho thấy rằng những vùng ba nucleotide lặp lại là bảo tồn nhiều hơn về chiều dài lặp lại giữa con người và lợn hơn giữa con người và động vật gặm nhấm [31].
Các bệnh thoái hóa thần kinh
bệnh Alzheimer là một bệnh thần kinh đa yếu tố và xảy ra ở một số gia đình như là một rối loạn trội NST thường thấy những cơn đau sau 40 năm. Đột biến gây bệnh đã được xác định trong các gen protein amyloid tiền thân (APP), dẫn đến sự gia tăng sản xuất của các mảnh protein khác nhau mà trong kết quả lần lượt trong các bệnh thần kinh. Để phát triển một mô hình lợn cho bệnh Alzheimer, lợn biến đổi gen đã được sản xuất bằng cách sử dụng các allele đột biến chi phối con người APPsw chứa chấp hai sàn axit amin do hai sàn nucleotide lân cận đã được tìm thấy để gây ra bệnh Alzheimer. Theo nghiên cứu ở chuột biến đổi gen trước, một gen chuyển 7,5 kb được xây dựng với một tiểu cầu có nguồn gốc từ 1-kb yếu tố sinh trưởng-beta promoter, trình tự intronic và exonic của gen beta-globin, các cDNA mã hóa các allele APPsw đột biến, và các chuỗi polyadenylate SV40 . Sau khi sửa đổi di truyền ổn định của nguyên bào sợi của minipig giống Göttingen, một clone tế bào biến đổi gen đã được sử dụng cho SCNT để sản xuất bảy lợn nhân bản biến đổi gen khỏe mạnh tăng cân bình thường. Những con lợn biến đổi gen nuôi dưỡng một bản sao đầy đủ độ dài duy nhất của gen chuyển trong hệ gen của mình và cho thấy mạnh mẽ, biểu hiện promoterspecific của protein biến đổi gen trong mô não. Lũy kế protein gây bệnh và sự xuất hiện tiếp theo của hậu quả lâm sàng đã được ước lượng để phát triển với sự gia tăng tuổi [32]. Bệnh Huntington là một tính trạng trội, rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển liên quan đến sự mất sớm của tế bào thần kinh cụ thể. Nó được kết hợp với sự mở rộng của một CAG ba nucleotide lặp lại trong khu vực của gen huntingtin (HTT) mà kết quả trong một đường polyglutamine kéo dài của các protein 5 '. Số CAG lặp lại có tính đa hình, dao động 6-35 đơn vị trong alen bình thường và 36-120 đơn vị trong alen liên quan đến bệnh Huntington. Các 12,8-kb HTT bảng điểm của Göttingen mã minipigs cho một protein 345-kDa (3139 axit amin) [33]. Các gen chuyển 8,2 kb sử dụng để vi tiêm DNA vào phôi minipig gồm 4-kb neuronspecific rat enolase (NSE) promoter, 3,3 kb 5 'minipig huntingtin cDNA được biến đổi bằng cách chèn 75 CAG lặp đi lặp lại vào khu vực ba của exon 1, và một 0,9-kb SV40 tín hiệu polyadenylate. Năm con lợn sáng lập chuyển gen được sản xuất mỗi chứa 1-3 trang web tích hợp khác nhau với số lượng bản sao biến và dấu hiệu của gen khảm