9.2. Description of antiparasitic b

9.2. Description of antiparasitic bio-assays
9.2.1. In vitro model for Leishmania
As already mentioned, the visceral speciesLeishmania donovaniorLeishmania infantumare best suited for drug screening. The use of promastigotes must be discouraged, because of
lower level of validation. To prepare the inoculum for infection,
amastigotes are harvested from the spleen of infected donor hamsters. Murine peritoneal macrophages are generally used as host
cell and are obtained after intraperitoneal stimulation with 2%
starch in water. The peritoneal cells are harvested about 24–48 h
later and plated in 96-well microplates at about 10
4
cells/well.
After adding 10
5
amastigotes per well and 5 days of incubation, parasite burdens are microscopically assessed after Giemsa
staining. The recent establishment of axenic amastigotes might
allow the implementation of colorimetric or fluorometric methods without the need for host cells (Debrabant et al., 2004).
9.2.2. In vitro model for African trypanosomes
Because of the non-pathogenicity for man, a drug sensitive Trypanosoma bruceistrain is preferred for primary screening purposes. If appropriate laboratory containment can be guaranteed, strains ofTrypanosoma gambienseorTrypanosoma rhodesiensecan be used as well. The bloodstream (trypomastigote)
forms are axenically grown in Hirumi-9 (HMI) medium (Hirumi and Hirumi, 1989)at37◦C under an atmosphere of 5% CO2. Assays are performed in 96-well tissue culture plates, each well containing about 10 4 parasites. After 4 days incubation, parasite growth is assessed by adding Alamar Blue TM or resazurin for fluorimetric reading (excitation 530 nm; emission 590 nm) after 4 h at 37◦ C(Raz et al., 1997).
9.2.3. In vitro model for Chagas disease
According to existing bio-safety guidelines,Trypanosoma cruziis a biohazard class-3 pathogen and all laboratory work should be carried out under BSL-3 containment. Particularly strict safety precautions must be adopted (working in a LAF safety cabinet, wearing gloves, a safety mask and a laboratory safety gown). Extreme care has to be taken with needles to prevent puncture accidents. The Tulahuen strain ofTrypanosoma cruziis nifurtimox-sensitive and can be maintained on MRC-5 cells. Assays are performed in 96-well tissue culture plates, each well containing the compound dilutions together with 3×10 3 MRC-5 cells and 3×10 4 parasites. Recently, a strain transfected with -galactosidase (Lac Z) gene has been developed
enabling colorimetric reading after addition of chlorophenolred -d-galacto-pyranoside as substrate (Buckner et al., 1996).
9.2.4. In vitro model for malaria
Of the four species that infect humans, onlyPlasmodium falciparumcan be cultured in vitro. Several strains can be used and it is advised to include drug-sensitive as well as drugresistant strains in the primary screening panel. Drug-sensitive strains are for example GHA, FCR3, NF54 and D6 that are susceptible to chloroquine, quinine and pyrimethamine. Drug resistant strains include W-2 and K1, known to be resistant to chloroquine, quinine and pyrimethamine, but susceptible to 300 P. Cos et al. / Journal of Ethnopharmacology 106 (2006) 290–302 mefloquine. The strains are maintained in continuous log phase growth in RPMI-1640 medium supplemented with 10% human serum and 4% human erythrocytes (Trager and Jensen, 1976). The human serum can also be replaced by lipid-rich bovine serum albumin (AlbuMAXII). All cultures are conducted at 37◦C under micro-aerophilic (4% CO2,3%O2 and 93% N2) atmosphere. The screening assay is an adaptation of the procedure described byDesjardins et al. (1979)andMakler et al.(1993)as the parasite lactate dehydrogenase assay. Assays are performed in 96-well tissue culture plates, each well containing the compound dilutions together with the parasite inoculum (1% parasitaemia, 2% haematocrit). After 72 h of incubation at 37◦C,plates are stored at−20◦C until further processing. After thawing, 20
l of haemolysed parasite suspension from each well is transferred into another plate together with 100
l Malstat TM reagent and 10
l of a 1/1 mixture of phenazine ethosulphate (PES, 2 mg/ml) and NBT (Nitro Blue Tetrazolium Grade III, 0.1 mg/ml). The plates are kept in the dark for 2 h and change in colour is measured spectrophotometrically at 655 nm. Alternatives to the Malstat assay for quantification of parasite growth is [
3
H]-hypoxanthine incorporation assay (addition of 0.2
Ci
and reading with liquid scintillation counter after 24 h), the use
of the DNA fluorochrome Picogreen
®
(Corbett et al., 2004)or simple microscopic reading of Giemsa-stained smears.

Kết quả (Việt) 1:

9.2. Mô tả antiparasitic bio-thử nghiệm9.2.1. trong ống nghiệm mô hình cho máiNhư đã đề cập, nội tạng speciesLeishmania donovaniorLeishmania infantumare tốt nhất phù hợp cho kiểm tra ma túy. Việc sử dụng của promastigotes phải được khuyến khích, vìcấp độ thấp hơn của xác nhận. Để chuẩn bị inoculum cho nhiễm trùng,amastigotes được thu hoạch từ lá lách của chuột đồng nhà tài trợ bị nhiễm bệnh. Các đại thực bào phúc mạc thường được sử dụng như là máy chủ lưu trữtế bào và là thu được sau khi lượng kích thích với 2%tinh bột trong nước. Các tế bào màng bụng được thu hoạch khoảng 24-48 hsau đó và mạ trong 96-cũng khoảng lúc khoảng 104tế bào/tốt.Sau khi thêm 105amastigotes một tốt và 5 ngày ấp, ký sinh trùng gánh nặng microscopically được đánh giá sau khi Giemsanhuộm. Việc thành lập tại axenic amastigotes có thểcho phép thực hiện phương pháp colorimetric hoặc fluorometric mà không có sự cần thiết cho máy chủ lưu trữ tế bào (Debrabant và ctv., 2004).9.2.2. trong ống nghiệm mô hình cho Châu Phi trypanosomesVì phòng không-bài cho người đàn ông, một bruceistrain Trypanosoma nhạy cảm thuốc được ưa thích cho các mục đích kiểm tra chính. Nếu chính sách ngăn chặn phòng thí nghiệm thích hợp có thể được đảm bảo, chủng ofTrypanosoma gambienseorTrypanosoma rhodesiensecan được sử dụng như là tốt. Máu (trypomastigote)hình thức axenically được phát triển trong môi trường Hirumi-9 (HMI) (Hirumi và Hirumi, 1989) at37◦C dưới một bầu không khí của 5% CO2. Thử nghiệm được thực hiện trong 96-cũng mô nền văn hóa tấm, cũng có khoảng 10 4 ký sinh trùng. Sau 4 ngày ấp, ký sinh trùng phát triển được đánh giá bằng cách thêm Alamar Blue TM hoặc resazurin cho fluorimetric đọc (kích thích 530 nm; phát thải 590 nm) sau khi 4 h 37◦ C (Raz và ctv., 1997).9.2.3. trong ống nghiệm mô hình cho bệnh ChagasTheo hướng dẫn an toàn sinh học hiện có, Trypanosoma cruziis một biohazard lớp-3 gây bệnh cho cây và tất cả các phòng thí nghiệm làm việc nên được thực hiện theo chính sách ngăn chặn BSL-3. Biện pháp phòng ngừa đặc biệt nghiêm ngặt an toàn phải được thông qua (làm việc trong tủ an toàn LAF, đeo găng tay, một mặt nạ an toàn và một áo choàng an toàn phòng thí nghiệm). Cực chăm sóc đã được thực hiện với kim để ngăn ngừa tai nạn đâm thủng. Tulahuen căng thẳng ofTrypanosoma cruziis nifurtimox-nhạy cảm và có thể được duy trì trên các tế bào MRC-5. Thử nghiệm được thực hiện trong 96-cũng mô nền văn hóa tấm, cũng có dilutions hợp chất cùng với các tế bào MRC-5 × 10 3 3 và 3 × 10 4 ký sinh trùng. Gần đây, một chủng transfected với - hoá (Lac Z) gen đã được phát triểncho phép colorimetric đọc sau khi bổ sung chlorophenolred -d-galacto-pyranoside là chất nền (Buckner và ctv., 1996).9.2.4. trong ống nghiệm mô hình cho bệnh sốt rét Bốn loài mà con người, gây bệnh onlyPlasmodium falciparumcan được nuôi cấy trong ống nghiệm. Một vài giống có thể được sử dụng và nó được khuyên nên bao gồm thuốc-nhạy cảm cũng như drugresistant chủng trong bảng điều khiển chính kiểm tra. Nhạy cảm với thuốc chủng là ví dụ: GHA, FCR3, NF54 và tuyến đường D6 sẽ dễ bị chloroquine, quinin và pyrimethamine. Kháng thuốc chủng bao gồm W-2 và K1, được biết đến là khả năng kháng chloroquine, quinin và pyrimethamine, nhưng dễ bị 300 P. Cos et al. / tạp chí Ethnopharmacology 106 (2006) 290-302 mefloquine. Các chủng được duy trì trong sự phát triển giai đoạn liên tục đăng nhập tại RPMI-1640 vừa bổ sung huyết thanh của con người 10% và 4% hồng cầu của con người (Trager và Jensen, 1976). Huyết thanh của con người cũng có thể được thay thế bởi giàu chất béo bò huyết thanh albumin (AlbuMAXII). Tất cả các nền văn hóa được tổ chức tại 37◦C dưới bầu khí quyển của vi-aerophilic (4% CO2, 3% O2 và 93% N2). Kiểm tra khảo nghiệm là một sự thích nghi của các thủ tục mô tả byDesjardins et al. (1979) andMakler et al. (1993) như khảo nghiệm lactate dehydrogenase ký sinh trùng. Thử nghiệm được thực hiện trong 96-cũng mô nền văn hóa tấm, cũng có dilutions hợp chất cùng với inoculum ký sinh trùng (1% parasitaemia, 2% haematocrit). Sau 72 h của ủ bệnh tại 37◦C, tấm là được lưu trữ at−20◦C cho đến khi chế biến tiếp. Sau khi tan, 20 l haemolysed ký sinh trùng tạm dừng từ mỗi cũng được chuyển thành một tấm cùng với 100 l Malstat TM tinh khiết và 10 l một hỗn hợp 1/1 phenazine ethosulphate (PES, 2 mg/ml) và NBT (Nitro Blue Tetrazolium lớp III, 0.1 mg/ml). Các mảng được lưu giữ trong bóng tối cho 2giờ và thay đổi màu đo spectrophotometrically tại 655 nm. Lựa chọn thay thế để khảo nghiệm Malstat nhất định lượng của ký sinh trùng tăng trưởng là [3H]-hypoxanthine tham khảo nghiệm (bổ sung của 0.2 Ci"và đọc với lỏng nhấp nháy truy cập sau 24 h), việc sử dụngcủa DNA fluorochrome Picogreen®(Corbett et al, 2004) hoặc đơn giản đọc vi của kính màu Giemsa smears.

Kết quả (Việt) 2:

9.2. Mô tả của ký sinh trùng sinh học xét nghiệm
9.2.1. Trong mô hình in vitro cho Leishmania
Như đã đề cập, các nội tạng speciesLeishmania donovaniorLeishmania infantumare phù hợp nhất để sàng lọc thuốc. Việc sử dụng các promastigotes phải được khuyến khích, vì
cấp dưới của xác nhận. Để chuẩn bị ổ bệnh nhiễm trùng,
amastigotes được thu hoạch từ lá lách của chuột đồng các nhà tài trợ bị nhiễm bệnh. Đại thực bào màng bụng của chuột thường được sử dụng như máy chủ
di động và thu được sau khi kích thích phúc mạc với 2%
tinh bột trong nước. Các tế bào màng bụng được thu hoạch khoảng 24-48 h
sau và mạ trong 96 giếng microplates khoảng 10
4
tế bào / giếng.
Sau khi thêm 10
5
amastigotes mỗi giếng và 5 ngày ấp, gánh nặng ký sinh trùng được bằng kính hiển vi đánh giá sau khi Giemsa
nhuộm. Việc thành lập gần đây của amastigotes axenic có thể
cho phép thực hiện các phương pháp so màu hoặc fluorometric mà không cần cho tế bào vật chủ. (Debrabant et al., 2004)
9.2.2. Trong mô hình in vitro cho trypanosomes Phi
Do không gây bệnh cho con người, một loại thuốc nhạy cảm Trypanosoma bruceistrain được ưa thích để sàng lọc sơ cấp. Nếu ngăn phòng thí nghiệm thích hợp có thể được đảm bảo, chủng ofTrypanosoma gambienseorTrypanosoma rhodesiensecan được sử dụng như là tốt. Máu (trypomastigote)
hình thức được axenically trồng ở Hirumi-9 (HMI) trung bình (Hirumi và Hirumi, 1989) at37◦C dưới một bầu không khí 5% CO2. Xét nghiệm được thực hiện trong các phiến nuôi cấy mô 96 giếng, mỗi giếng có chứa khoảng 10 4 ký sinh trùng. Sau 4 ngày ủ bệnh, ký sinh trùng phát triển được đánh giá bằng cách thêm Alamar xanh TM hoặc resazurin đọc fluorimetric (kích thích 530 nm; phát thải 590 nm) sau 4 h tại 37◦ C. (Raz et al., 1997)
9.2.3. Trong mô hình ống nghiệm cho bệnh Chagas
Theo hướng dẫn an toàn sinh học hiện có, Trypanosoma cruziis thảm họa sinh lớp 3 tác nhân gây bệnh và tất cả các công việc trong phòng thí nghiệm nên được thực hiện theo BSL-3 ngăn chặn. Biện pháp phòng ngừa đặc biệt nghiêm ngặt về an toàn phải được thông qua (làm việc trong một tủ an toàn LAF, đeo găng tay, mặt nạ an toàn và một áo choàng an toàn trong phòng thí nghiệm). Cực chăm sóc phải được thực hiện với kim để ngăn ngừa tai nạn đâm. Các Tulahuen căng ofTrypanosoma cruziis nifurtimox nhạy cảm và có thể được duy trì trên MRC-5 ô. Xét nghiệm được thực hiện trong các phiến nuôi cấy mô 96 giếng, mỗi giếng có chứa các hợp chất pha loãng cùng với 3 × 10 3 MRC-5 tế bào và 3 × 10 4 ký sinh trùng. Gần đây, một chủng transfected với? -galactosidase (Lac Z) gen đã được phát triển
cho phép đọc đo màu sau khi bổ sung chlorophenolred? -d-Galacto-pyranoside như chất nền. (Buckner et al., 1996)
9.2.4. Trong mô hình ống nghiệm cho bệnh sốt rét
Trong bốn loài gây bệnh cho người, onlyPlasmodium falciparumcan thể nuôi cấy in vitro. Một số chủng có thể được sử dụng và nó được khuyên nên bao gồm nhạy cảm với thuốc cũng như các chủng drugresistant trong bảng sàng lọc sơ cấp. Các chủng nhạy cảm với thuốc là ví dụ GHA, FCR3, NF54 và D6 mẫn cảm với chloroquine, quinine và pyrimethamine. Chủng kháng thuốc gồm có W-2 và K1, được biết đến là khả năng kháng chloroquine, quinine và pyrimethamine, nhưng dễ bị 300 P. Cos et al. / Tạp chí Ethnopharmacology 106 (2006) 290-302 mefloquine. Các chủng được duy trì liên tục trong giai đoạn tăng trưởng log trong môi trường RPMI-1640 có bổ sung 10% huyết thanh người và 4% hồng cầu của con người (Trager và Jensen, 1976). Các huyết thanh người cũng có thể được thay thế bằng lipid giàu albumin huyết thanh bò (AlbuMAXII). Tất cả các nền văn hóa được tiến hành tại 37◦C dưới vi aerophilic (4% CO2,3% O2 và 93% N2) bầu không khí. Xét nghiệm sàng lọc là một sự thích nghi của các thủ tục được mô tả byDesjardins et al. (1979) andMakler et al. (1993) như ký sinh trùng lactate dehydrogenase khảo nghiệm. Xét nghiệm được thực hiện trong các phiến nuôi cấy mô 96 giếng, mỗi giếng có chứa các hợp chất pha loãng cùng với tác nhân gây bệnh ký sinh trùng (1% ký sinh trùng, 2% hematocrit). Sau 72 giờ ủ ở 37◦C, tấm được bảo quản ở-20◦C cho đến khi chế biến tiếp. Sau khi giải đông, 20? L đình chỉ ký sinh trùng haemolysed từ mỗi giếng được chuyển vào tấm khác nhau với 100? L Malstat TM thuốc thử và 10? L của một hỗn hợp 1/1 của phenazine ethosulphate (PES, 2 mg / ml) và NBT ( Nitro Xanh tetrazolium hạng III, 0,1 mg / ml). Các tấm được giữ trong bóng tối cho 2 h và thay đổi màu được đo spectrophotometrically tại 655 nm. Thay thế cho việc khảo nghiệm Malstat để định lượng tăng trưởng là ký sinh trùng
[3
H] -hypoxanthine khảo nghiệm thành lập công ty (thêm 0,2 Ci?
Và đọc sách với chất lỏng lấp lánh phản sau 24 h), việc sử dụng
của các DNA fluorochrome Picogreen
®
(Corbett et al., 2004) hoặc đọc bằng kính hiển vi đơn giản của smears Giemsa-nhuộm màu.