Comparison of two different sets of

Comparison of two different sets of RT-PCR primers
Sensitivity of RT-PCR using primers NCD7/NCD8 was compared with
the sensitivity of RT-PCR using primers NCD3/NCD4. For RT sense
primer NCD3 (59 -GTCAACATATAC ACCTCATC-39 ), corresponding
to nucleotides 194 to 213 of the F0-gene, cDNA was used; for PCR
antisense primer NCD4 (59 -GGAGGATGTTGGCAGCATT-39 ), complementary
to nucleotides 485 to 503 of the F0-gene, cDNA was sued
(St¨auber et al., 1995), by testing tenfold dilution series of vaccines
(TAD ND vac LaSota and TAD ND vac HitchnerB1).
Specificity of RT-PCR
To test the cross-reactivity, i.e. specificity, of the NCD7/NCD8 RT-PCR,
APMV-serotypes 3, 4, 6, 7, 8 and 9, rehydrated in sterile RNAse free
water were used. Restriction endonuclease digestion of RT-PCRamplified
182 bp DNA from AMPV-1 was used to confirm the
specificity of the RT-PCR. One microlitre (8000U/m l) of endonuclease
Alu I (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) was added directly to
20 m l of the RT-PCR mix after amplification. Samples were incubated at
37°C overnight. Ten microlitres of the undigested and Alu I-cleaved RTPCR
product were analysed on ethidium bromide-stained 4% agarose
gels. Plasmid pBlueScript (Stratagene, Zurich, Switzerland) digested
with Sau3A, or 100 bp double-stranded DNA ladder (Life Technologies ,
Basel, Switzerland), respectively, were used as size markers.
Results
Initial experiment
Samples from highly parenchymatous organs, such
as brain, liver and kidney, always yielded high
background signals when used undiluted, which
disappeared when RT-PCR was performed with
1:10 diluted RNA samples (see section on the time
course experiment and Figure 1). Samples resulting most frequently in a specific DNA band and few
background signals were conjunctiva, lung, bronchial
lavage and trachea. No single organ always
scored positive in all infected animals. Liver,
intestine and intestinal contents never yielded
positive results.

Kết quả (Việt) 1:

So sánh hai bộ khác nhau của RT-PCR lớp lótĐộ nhạy của RT-PCR sử dụng chất nền, mồi NCD7/NCD8 được so sánh vớiđộ nhạy của RT-PCR sử dụng lớp lót NCD3/NCD4. Cho cảm giác RTChất mồi đệm NCD3 (59 - GTCAACATATAC ACCTCATC-39), tương ứngđể nucleotide 194 để 213 của F0-gene, cDNA được sử dụng; cho Đảng Cộng sản Romaniaantisense mồi NCD4 (59 - GGAGGATGTTGGCAGCATT-39), bổ sungđể nucleotide 485 để 503 của F0-gene, cDNA đã bị kiện(St¨auber et al., 1995), bằng cách kiểm tra mười lần pha loãng loạt vắc xin(TAD ND vac LaSota và TAD ND vac HitchnerB1).Đặc trưng của RT-PCRĐể kiểm tra cross-reactivity, tức là đặc trưng, của NCD7/NCD8 RT-PCR,APMV-serotypes 3, 4, 6, 7, 8 và 9, hydrat trong vô trùng RNAse miễn phínước được sử dụng. Hạn chế endonuclease tiêu hóa của RT-PCRamplified182 bp DNA từ AMPV-1 được sử dụng để xác nhận cácđặc trưng của RT-PCR. Một microlitre (8000U/m l) của endonucleaseAlu tôi (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) đã được thêm trực tiếp vào20 m l của sự pha trộn RT-PCR sau khi khuếch đại. Mẫu đã được ủ tại37° C qua đêm. Mười microlitres của các không tiêu hóa và Alu tôi-cảm RTPCRsản phẩm được phân tích trên ethidium màu bromua 4% agaroseGel. Plasmid pBlueScript (Stratagene, Zurich, Thuỵ Sỹ) tiêu hóavới Sau3A, hoặc 100 bp đôi-stranded DNA bậc thang (cuộc sống công nghệ,Basel, Thụy sĩ), tương ứng, được sử dụng như kích thước đánh dấu.Kết quảBan đầu thử nghiệmMẫu từ rất parenchymatous cơ quan, như vậynhư não, gan và thận, luôn luôn mang lại caotín hiệu nền khi sử dụng undiluted, màbiến mất khi Đảng Cộng sản Romania RT được thực hiện với1:10 pha loãng RNA mẫu (xem phần về thời giankhóa học thử nghiệm và hình 1). Mẫu dẫn đến thường xuyên nhất trong một ban nhạc DNA cụ thể và ítnền tín hiệu là tiếp hợp mạc, phổi, phế quảnrửa và khí quản. Không có cơ quan duy nhất luôn luônghi tích cực trong tất cả các loài động vật bị nhiễm bệnh. Gan,nội dung ruột và ruột không bao giờ mang lạikết quả tích cực.

Kết quả (Việt) 2:

So sánh hai bộ khác nhau của RT-PCR mồi
nhạy của RT-PCR sử dụng cặp mồi NCD7 / NCD8 được so sánh với
sự nhạy cảm của RT-PCR sử dụng cặp mồi NCD3 / NCD4. Đối với RT cảm giác
mồi NCD3 (59 -GTCAACATATAC ACCTCATC-39), tương ứng
với nucleotide 194-213 của F0-gen, cDNA được sử dụng; cho PCR
antisense mồi NCD4 (59 -GGAGGATGTTGGCAGCATT-39), bổ sung
để nucleotide 485-503 của F0-gen, cDNA đã bị kiện
(Stauber et al., 1995), bằng cách kiểm tra gấp mười lần pha loãng loạt các loại vắc-xin
(TAD NĐ vac LaSota và TAD NĐ vac HitchnerB1).
đặc hiệu của RT-PCR
để kiểm tra phản ứng chéo, tức là tính đặc trưng, ​​những NCD7 / NCD8 RT-PCR,
APMV-type huyết thanh 3, 4, 6, 7, 8 và 9, hydrat trong vô trùng RNase free
nước đã được sử dụng. Restriction endonuclease tiêu hóa của RT-PCRamplified
182 bp DNA từ AMPV-1 đã được sử dụng để xác nhận các
đặc trưng của RT-PCR. Một microlitre (8000U / ml) của endonuclease
Alu I (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) đã được bổ sung trực tiếp đến
20 ml của RT-PCR trộn sau khi khuếch đại. Các mẫu được ủ ở
37 ° C qua đêm. Mười microlitres của RTPCR không tiêu hóa và Alu I-chẻ
sản phẩm đã được phân tích trên ethidium bromide nhuốm 4% agarose
gel. Plasmid pBlueScript (Stratagene, Zurich, Thụy Sĩ) tiêu hóa
với Sau3A, hoặc 100 bp DNA sợi kép thang (Technologies Life,
Basel, Thụy Sĩ), tương ứng, được sử dụng như là dấu hiệu kích thước.
Kết quả
thử nghiệm ban đầu
mẫu từ các cơ quan có nhu mô, chẳng hạn
như não , gan và thận, luôn luôn mang lại cao
tín hiệu nền khi sử dụng nguyên chất, trong đó
biến mất khi RT-PCR được thực hiện với
1:10 mẫu RNA pha loãng (xem phần về thời gian
thử nghiệm nhiên và Hình 1). Mẫu kết quả thường xuyên nhất trong một band DNA cụ thể và vài
tín hiệu nền có kết mạc, phổi, phế quản
rửa và khí quản. Không có cơ quan duy nhất luôn luôn
ghi được tích cực trong tất cả các loài động vật bị nhiễm bệnh. Gan,
ruột và ruột không bao giờ mang lại
kết quả tích cực.