MATERIALS AND METHODSCONSTRUCTION O

MATERIALS AND METHODS
CONSTRUCTION OF G-CSF EXPRESSION VECTOR
The hG-CSF gene was fused to both goat and bovine DNA sequences of s1-casein gene (CSN1S1). The DNA construct was inserted into a plasmid vector, namedpGCm3 (Fig. 1). This expression vector was designed based on pGCm1 and pGCm2 previously described and used for production of transgenic mouse (Dvoryanchikov et al. 2005). The pGCm3 DNA insert (6429 bp) has a 5'flanking fragment (3387 bp) originated from goat CSN1S1 gene (Ramunno et al. 2004). This fragment includes a promoter region, the first exon, the first intron and the 12 bp from second exon. In pGCm3 construct, there is the full-length hG-CSF gene (1504 bp) followed by 3'flanking fragment (1538 bp) originated from bovine CSN1S1 gene. The last sequence includes the exon 18, the intron 18, the exon 19 and a 3'-untranslated region (3'UTR).


DNA PREPARATION FOR ZYGOTE MICROINJECTION
The DNA insert was cut out from pGCm3 using SalI digestion. After fractionating the digests in 0.7% agarose gel, a 6431 bp fragment was isolated. The fragment was eluted from agarose gel using Qiagen® columns according to recommendations of the manufacturer. For injections, DNA was diluted in 0.01 M Tris-HCl with 0.25 mM EDTA, at pH 7.4.
EXPERIMENTAL ANIMALS AND ETHICS
A total of 23 adult Saanen goats (1-5 years old) were used as embryo donors in this study, while 48 undefined breed goats (2-5 years old) served as recipients for the microinjected embryos. The study was carried out between mid-January and mid-February 2006. Studies were conducted in conformance with guidelines of animal care. This project was approved by the Animal Ethics Committee of the State University of Ceará (CEUA/UECE) as well as the Biosecurity National Technical Committee (CTNBio).
ESTRUS SYNCHRONIZATION AND SUPEROVULATION
The timing of estrus was synchronized in donors and recipients with intravaginal sponges (Progespon, Syntex, Buenos Aires, Argentina) containing 60 mg medroxyprogesterone acetate for 10 days and an injection of 75 µg cloprostenol (Prolise, Arsa, Buenos Aires, Argentina) on the morning of the eighth day. Donors received a total equivalent to 200 mg NIH-FSH-P1 (Folltropin-V, Vetrepharm, Ontario, Canada) given twice daily in decreasing doses over 3 days (50/50, 25/25 and 25/25 mg) starting 48 h prior to sponge removal. Also 48 h prior to the endof progestagen treatment, recipients were injected with 300 IU eCG (Novormon, Syntex, Buenos Aires, Argentina). Thirty-six hours after sponge removal, donors received 100 mg GnRH (Fertagyl, Intervet, Boxmeer, Holanda). Donors were hand bred at 36 and 48 h after sponge removal using Saanen bucks of known fertility.
EMBRYO RECOVERY
Donors and recipients were deprived of food and water for 24 h prior embryo recovery and transfer. Embryos were surgically recovered 72 h following sponge removal. A low dose (0.1 mg/kg) of xylazine hydrochloride (Rompun, Bayer, São Paulo, Brazil) was intramuscularly injected as a preanesthetic agent. After a peridural injection (7 mg/kg) of lidocaine (Anestésico L, Eurofarma, São Paulo, Brazil) a mid-ventral incision was made and the reproductive tract was exteriorized. Ovaries were observed for fresh ovulation sites to serve as an estimate of the number of embryos expected. The oviduct was then flushed retrogradely with 10-15 ml of sterile phosphate-buffered saline. The flushing medium was collected into sterile Petri dishes and examined under a stereomicroscope (Nikon SMZ-800, Kawasaki, Japan) for the presence of ova/embryos.
EMBRYO MANIPULATION AND MICROINJECTION
The microinjection was carried out using only fertilized one-cell embryos. In order to visualize pronuclei all zygotes were briefly centrifuged at 13,400 rpm for 4-6 min. After centrifugation, if the pronuclei were not visible, they were placed in droplets of M-2 medium supplemented with 10% FCS and covered with mineral oil, and briefly cultured at 37ºC with 5% CO2. The zygotes with visible pronuclei were placed in droplets of M-16 medium supplemented with 10% FCS prior to microinjection, which was performed under inverted microscope with DIC optics (Nikon TE2000, Kawasaki, Japan) and a pair of micromanipulators (Narishige, Tokio, Japan). The DNA fragment isolated from a plasmid containing the pGCm3 gene was injected into the one of two pronuclei in volume of 1-2 pl. Noticeable swelling of thenuclei was the criterion for successful microinjection. Microinjected embryos were cultured for 1-2 h at 37ºC with 5% CO to evaluate post injection survival. The surviving zygotes were maintained in culture until embryo transfer. Non-injected zygotes with invisible pronuclei were further cultured to confirm fertilization by cleavage.
EMBRYO TRANSFER AND PREGNANCY DIAGNOSIS
Successfully microinjected embryos were transferred into the oviduct of estrus-synchronized recipient goats following laparoscopic exploration in order to confirm the presence of at least one recent ovulation. For embryo transfer, a mid-ventral laparotomy was established and the reproductive tract was exteriorized. A Tomcat catheter containing the embryos was introduced through the fimbria 2-3 cm into the oviduct and the embryos were injected into the lumen. Three to six embryos were transferred per recipient. Pregnancy was detected by ultrasound at 28-35 days following transfer, using a Falco 100 scanner (Piemedical, Maastricht, The Netherlands) equipped with a transrectal 6-8 MHz linear array.
IDENTIFICATION OF TRANSGENIC GOATS
DNA was extracted from skin biopsies taken from the ears of 2-week-old kids. After proteinase-K/SDS treatment, a phenol-chloroform extraction was performedfollowing the protocol of Sambrook et al. (1989). The identification of transgenic animals was carried out by PCR amplification using the following pairs of primers: PrA/PrB and PrC/PrD, originating products of 700 bp and 530 bp, respectively (Table I). The reaction control was made with a pair of primers designed to 5'-flanked sequence of goat as1-casein gene (496 bp PCR product). The PCR was performed using 1 µg of genomic DNA, 1 µM of each primer and 0.5 U of Taq polymerase to a total volume of 25 µL. The amplification was conducted under following conditions: denaturing for 3 minutes at 95ºC, then 35 cycles (30s at 95ºC, 30s at 55ºC and 30s at 72ºC) and the final stage for 5min at 72ºC. The PCR products were analyzed by electrophoresis in a 1.5 or 3% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining.


STATISTICAL ANALYSIS
Data were expressed as mean ± SEM. Differences between means were based on t-test. Probability of < 0.05 was considered to be significant statistically

Kết quả (Việt) 1:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPXÂY DỰNG CỦA G-CSF BIỂU HIỆN VECTORGen hG-CSF được hợp nhất với cả dê và bò trình tự ADN của s1-casein gen (CSN1S1). Xây dựng DNA được chèn vào một plasmid vector, namedpGCm3 (hình 1). Vector biểu hiện này được thiết kế dựa trên pGCm1 và pGCm2 trước đây được mô tả và được sử dụng cho sản xuất của biến đổi gen chuột (Dvoryanchikov et al. 2005). PGCm3 DNA chèn (6429 bp) có một 5' sườn mảnh (3387 bp) có nguồn gốc từ dê CSN1S1 gen (Ramunno et al. năm 2004). Mảnh này bao gồm một khu vực promoter, exon đầu tiên, intron đầu tiên và 12 bp từ exon thứ hai. Trong pGCm3 xây dựng, đó là đầy đủ độ dài hG-CSF gen (1504 bp) theo sau 3' sườn mảnh (1538 bp) có nguồn gốc từ bò CSN1S1 gen. Trình tự cuối bao gồm exon 18, intron 18, exon 19 và một khu vực 3'-phải (3' Maldegem). ADN ĐỂ CHUẨN BỊ CHO HỢP TỬ MICROINJECTIONChèn DNA đã được cắt từ pGCm3 bằng cách sử dụng SalI tiêu hóa. Sau khi fractionating tiêu hóa ở 0,7% agarose gel, một mảnh 6431 bp đã bị cô lập. Mảnh được eluted từ agarose gel bằng cách sử dụng Qiagen ® cột theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Cho tiêm, DNA được pha loãng trong 0,01 M Tris-HCl với 0.25 mM EDTA, ở pH 7.4.THỬ NGHIỆM ĐỘNG VẬT VÀ ĐẠO ĐỨCTổng cộng 23 dê Saanen dành cho người lớn (1-5 tuổi) đã được sử dụng như là các nhà tài trợ phôi thai trong nghiên cứu này, trong khi 48 undefined giống dê (2-5 tuổi) là người nhận cho các phôi microinjected. Nghiên cứu được thực hiện từ giữa tháng Giêng đến giữa tháng hai năm 2006. Nghiên cứu đã được thực hiện trong sự phù hợp với nguyên tắc của chăm sóc động vật. Dự án này đã được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức của động vật của đại học bang Ceará (CEUA/UECE) cũng như các an toàn sinh học kỹ thuật Ủy ban quốc gia (CTNBio).ĐỘNG ĐỒNG BỘ HÓA VÀ SUPEROVULATIONThời gian của động được đồng bộ trong các nhà tài trợ và người nhận bằng bọt biển intravaginal (Progespon, Syntex, Buenos Aires, Argentina) có chứa 60 mg medroxyprogesterone axetat cho 10 ngày và tiêm 75 μg cloprostenol (Prolise, Arsa, Buenos Aires, Argentina) vào buổi sáng ngày thứ tám. Các nhà tài trợ đã nhận được tổng cộng tương đương với 200 mg NIH-FSH-P1 (Folltropin-V, Vetrepharm, Ontario, Canada) đưa ra hai lần hàng ngày trong giảm liều trong 3 ngày (50/50, 25/25 và 25/25 mg) bắt đầu 48 h trước khi loại bỏ miếng bọt biển. Cũng 48 h trước khi điều trị progestagen endof, người nhận được tiêm với 300 IU eCG (Novormon, Syntex, Buenos Aires, Argentina). Ba mươi sáu giờ sau khi loại bỏ miếng bọt biển, các nhà tài trợ nhận được 100 mg GnRH (Fertagyl, Intervet, Boxmeer, Holanda). Các nhà tài trợ đã là tay nuôi tại 36 và 48 h sau khi loại bỏ miếng bọt biển sử dụng Saanen bucks của khả năng sinh sản được biết đến.PHÔI PHỤC HỒICác nhà tài trợ và người nhận bị tước của thực phẩm và nước cho 24 h trước khi phôi phục hồi và chuyển giao. Phôi đã là phẫu thuật phục hồi 72 h sau loại bỏ miếng bọt biển. Một liều thấp các xylazine Hiđrôclorua (Rompun, Bayer, São Paulo, Brazil) (cách 0.1 mg/kg) đã được tiêm intramuscularly như một đại lý preanesthetic. Sau khi một tiêm peridural (7 mg/kg) lidocaine (Anestésico L, Eurofarma, São Paulo, Brazil), một vết rạch giữa bụng đã được thực hiện và đường sinh sản exteriorized. Buồng trứng đã được quan sát cho các trang web tươi rụng trứng để phục vụ như là một ước tính số lượng phôi dự kiến. Oviduct sau đó đỏ ửng retrogradely với 10-15 ml dung dịch muối đệm phosphat vô trùng. Xả vừa được thu thập vào vô trùng Petri món ăn và kiểm tra xem dưới một stereomicroscope (Nikon SMZ-800, Kawasaki, Nhật bản) có sự hiện diện của trứng/phôi.THAO TÁC PHÔI VÀ MICROINJECTIONMicroinjection được thực hiện bằng cách sử dụng chỉ thụ tinh một tế bào phôi. Để hình dung pronuclei tất cả zygotes đã được một thời gian ngắn ly 13,400 rpm cho 4-6 phút. Sau khi số, nếu pronuclei đã không nhìn thấy được, họ đã được đặt trong giọt của M-2 phương tiện bổ sung với 10% FCS và được bảo hiểm với dầu khoáng sản, và một thời gian ngắn nuôi cấy tại 37ºC với 5% CO2. Zygotes với pronuclei có thể nhìn thấy được đặt trong những giọt của M-16 phương tiện bổ sung với 10% FCS trước khi microinjection, được thực hiện dưới kính hiển vi ngược với DIC quang học (Nikon TE2000, Kawasaki, Nhật bản) và một cặp micromanipulators (Narishige, Tokio, Nhật bản). Đoạn DNA bị cô lập từ một plasmid có chứa pGCm3 gen đã được tiêm vào một trong hai pronuclei trong khối lượng 1-2 pl. đáng chú ý sưng thenuclei là các tiêu chí cho thành công microinjection. Microinjected phôi được nuôi cấy cho 1-2 h 37ºC với 5% CO để đánh giá bài tiêm tồn tại. Zygotes còn sống sót được duy trì trong văn hóa cho đến khi chuyển phôi. Tiêm phòng không zygotes với vô hình pronuclei đã sửa nuôi cấy thêm bởi cleavage, để xác nhận thụ tinh.CHẨN ĐOÁN CHUYỂN PHÔI VÀ MANG THAIThành công microinjected phôi được chuyển vào oviduct động đồng bộ hoá người nhận dê sau nội soi thăm dò để xác nhận sự hiện diện của ít nhất một sự rụng trứng tại. Đối với chuyển phôi, một laparotomy giữa bụng được thành lập và đường sinh sản exteriorized. Một ống thông Tomcat có chứa các phôi đã được giới thiệu thông qua fimbria 2-3 cm vào oviduct và các phôi đã được tiêm vào lumen. 3-6 phôi được chuyển giao cho mỗi người nhận. Mang thai được phát hiện bởi siêu âm tại 28-35 ngày sau chuyển, bằng cách sử dụng một Falco 100 máy quét (Piemedical, Maastricht, Hà Lan) được trang bị với một mảng transrectal 6-8 MHz tuyến tính.XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN ĐỔI GEN DÊDNA được chiết xuất từ da để Lấy từ tai của trẻ em 2 tuần tuổi. Sau khi điều trị proteinase K/dùng mũi SDS, khai thác phenol-clorofom là performedfollowing giao thức của Sambrook et al. (1989). Nhận dạng của động vật biến đổi gen đã được thực hiện bởi Đảng Cộng sản Romania khuếch đại bằng cách sử dụng các cặp sau đây của chất nền, mồi: PrA/PrB và Trung Quốc/PrD, có nguồn gốc từ các sản phẩm của 700 bp và 530 bp, tương ứng (bàn tôi). Kiểm soát phản ứng đã được thực hiện với một cặp chất nền, mồi được thiết kế để 5'-hai chuỗi con dê as1-casein gen (496 bp PCR sản phẩm). Đảng Cộng sản Romania được thực hiện bằng cách sử dụng 1 μg gen DNA, 1 μm của mỗi mồi và cách 0.5 U Taq polymerase để tất cả diện tích 25 ml. Khuếch đại được tiến hành theo các điều kiện sau đây: biến tính trong 3 phút tại 95ºC, sau đó 35 chu kỳ (30 tại 95ºC, độ tuổi 30 tại 55ºC và độ tuổi 30 tại 72ºC) và giai đoạn cuối cùng trong 5 phút tại 72ºC. Sản phẩm Đảng Cộng sản Romania đã được phân tích bằng điện trong một gel agarose 1,5 hoặc 3% và hình dung bởi ethidium bromua nhuộm. THỐNG KÊ PHÂN TÍCHDữ liệu được biểu thị dưới dạng có nghĩa là ± SEM khác biệt giữa phương tiện đã được dựa trên t-thử nghiệm. Xác suất của < 0,05 được coi là đáng kể về mặt thống kê

Kết quả (Việt) 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
XÂY DỰNG G-CSF EXPRESSION VECTOR
Gen HG-CSF đã được hợp nhất cho cả hai con dê và các trình tự DNA của gen bò s1-casein (CSN1S1). Các cấu trúc DNA đã được đưa vào một vector plasmid, namedpGCm3 (Fig. 1). Vector biểu hiện này được thiết kế dựa trên pGCm1 và pGCm2 mô tả trước đây và được sử dụng cho sản xuất của con chuột biến đổi gen (Dvoryanchikov et al. 2005). Các DNA chèn pGCm3 (6429 bp) có một mảnh 5'flanking (3387 bp) có nguồn gốc từ gen CSN1S1 dê (Ramunno et al. 2004). Đoạn này bao gồm một vùng promoter, các exon đầu tiên, các intron đầu tiên và 12 bp từ exon thứ hai. Trong pGCm3 xây dựng, có đầy đủ chiều dài gen hg-CSF (1504 bp) tiếp theo 3'flanking fragment (1538 bp) có nguồn gốc từ gen CSN1S1 bò. Các chuỗi cuối cùng bao gồm các exon 18, các intron 18, các exon 19 và một khu vực 3'-chưa được dịch (3'UTR). CHUẨN BỊ CHO DNA hợp tử vi tiêm DNA chèn được cắt ra từ pGCm3 sử dụng Sali tiêu hóa. Sau khi chưng cất các digest 0.7% gel agarose, một đoạn 6431 bp được phân lập. Các mảnh được rửa giải từ gel agarose sử dụng cột Qiagen® theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Đối với thuốc tiêm, DNA đã được pha loãng trong 0,01 M Tris-HCl với 0,25 mM EDTA, ở pH 7,4. ANIMALS NGHIỆM VÀ ĐẠO ĐỨC Có tổng cộng 23 người lớn Saanen dê (1-5 tuổi) đã được sử dụng như các nhà tài trợ phôi trong nghiên cứu này, trong khi 48 dê giống chưa xác định (2-5 tuổi) từng là người nhận cho phôi microinjected. Nghiên cứu được tiến hành từ giữa tháng và giữa tháng hai năm 2006. Các nghiên cứu được tiến hành trong sự phù hợp với hướng dẫn về chăm sóc động vật. Dự án này được sự chấp thuận của Ủy ban Animal Đạo đức của trường Đại học bang Ceará (CEUA / UECE) cũng như Ủy ban An toàn sinh học Kỹ thuật Quốc gia (CTNBio). Đồng bộ động dục và SUPEROVULATION Thời gian động dục được đồng bộ trong các nhà tài trợ và người nhận với bọt biển âm đạo ( Progespon, Syntex, Buenos Aires, Argentina) có chứa 60 mg acetate medroxyprogesterone trong 10 ngày và tiêm 75 mg cloprostenol (Prolise, Arsa, Buenos Aires, Argentina) vào sáng ngày thứ tám. Các nhà tài trợ nhận được tổng cộng tương đương với 200 mg NIH-FSH-P1 (Folltropin-V, Vetrepharm, Ontario, Canada) đưa ra hai lần mỗi ngày với liều lượng giảm hơn 3 ngày (50/50, 25/25 và 25/25 mg) bắt đầu từ 48 h trước khi loại bỏ bọt biển. Ngoài ra 48 h trước khi điều trị progestagen endof, người nhận được tiêm 300 IU ECG (Novormon, Syntex, Buenos Aires, Argentina). Ba mươi sáu giờ sau khi gỡ bỏ miếng bọt biển, các nhà tài trợ đã nhận được 100 mg GnRH (Fertagyl, Intervet, Boxmeer, Holanda). Các nhà tài trợ đã được bàn tay sinh sản tại 36 và 48 giờ sau khi gỡ bỏ miếng bọt biển sử dụng Saanen Bucks của khả năng sinh sản được biết đến. Phôi RECOVERY các nhà tài trợ và người nhận đã bị tước mất thức ăn và nước trong vòng 24 giờ trước khi thu phôi và chuyển giao. Phôi được phẫu thuật phục hồi 72 h sau cắt bỏ miếng bọt biển. Một liều thấp (0,1 mg / kg) của xylazine hydrochloride (Rompun, Bayer, São Paulo, Brazil) đã được tiêm bắp tiêm như một chất preanesthetic. Sau khi tiêm peridural (7 mg / kg) của lidocaine (Anestésico L, Eurofarma, São Paulo, Brazil) rạch một đường giữa bụng đã được thực hiện và đường sinh dục được exteriorized. Buồng trứng được quan sát thấy trong các trang web rụng trứng tươi để phục vụ như một ước tính số lượng phôi dự kiến. Các ống dẫn trứng thì bị xô retrogradely với 10-15 ml vô trùng đệm phosphat mặn. Các trung xả nước được thu thập vào các đĩa Petri vô trùng và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (Nikon SMZ-800, Kawasaki, Nhật Bản) cho sự hiện diện của trứng / phôi. Thao tác PHÔI VÀ tiêm các vi tiêm được thực hiện bằng cách sử dụng một tế bào phôi chỉ được thụ tinh. Để hình dung pronuclei tất cả các hợp tử được ly tâm một thời gian ngắn tại 13.400 rpm cho 4-6 phút. Sau khi ly tâm, nếu pronuclei không thấy được, chúng được đặt trong các giọt nhỏ của M-2 vừa bổ sung 10% FCS và được phủ dầu khoáng, và một thời gian ngắn nuôi ở 37ºC với 5% CO2. Các hợp tử với pronuclei có thể nhìn thấy được đặt trong các giọt nhỏ của M-16 vừa bổ sung 10% FCS trước khi tiêm, được thực hiện dưới kính hiển vi đảo ngược với DIC quang học (Nikon TE2000, Kawasaki, Nhật Bản) và một cặp micromanipulators (Narishige, Tokio, Nhật Bản). Đoạn DNA được phân lập từ một plasmid chứa gen pGCm3 được tiêm vào một trong hai pronuclei về khối lượng của 1-2 pl. Sưng đáng chú ý của thenuclei là tiêu chí cho vi tiêm thành công. Phôi Microinjected được nuôi cấy trong 1-2 h tại 37ºC với 5% CO để đánh giá bài tiêm tồn tại. Các hợp tử còn sống sót đã được duy trì trong văn hóa cho đến khi chuyển phôi. Không tiêm hợp tử với pronuclei vô hình được nuôi hơn nữa để khẳng định thụ tinh bởi sự phân cắt. CHUYỂN PHÔI VÀ THAI Chẩn đoán thành công phôi microinjected được chuyển vào ống dẫn trứng của dê nhận động dục đồng bộ sau đây thăm dò nội soi để xác nhận sự hiện diện của ít nhất một trứng rụng gần đây . Đối với chuyển phôi, mở bụng giữa bụng được thành lập và đường sinh dục được exteriorized. Một ống thông Tomcat chứa phôi đã được giới thiệu thông qua các fimbria 2-3 cm vào ống dẫn trứng và phôi được tiêm vào trong lòng. Ba đến sáu phôi được chuyển cho mỗi người nhận. Mang thai được phát hiện bằng siêu âm ở 28-35 ngày sau khi cấy, bằng cách sử dụng một máy quét Falco 100 (Piemedical, Maastricht, Hà Lan) được trang bị với một mảng tuyến tính trực tràng 6-8 MHz. XÁC ĐỊNH chuyển gien dê DNA được chiết xuất từ sinh thiết da lấy từ tai của trẻ 2 tuần tuổi. Sau khi điều trị proteinase-K / SDS, một chiết phenol-chloroform đã performedfollowing các giao thức của Sambrook et al. (1989). Việc xác định các loài động vật biến đổi gen đã được thực hiện bởi sự khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi sau: PRA / PRB và PRC / PRD, nguồn gốc sản phẩm của 700 bp và 530 bp, tương ứng (Bảng I). Việc kiểm soát phản ứng được thực hiện với một cặp mồi được thiết kế để tự 5'-hai bên của dê gen AS1-casein (sản phẩm PCR 496 bp). Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng 1 mg DNA của bộ gen, 1 mM của mỗi lớp sơn lót và 0,5 U của Taq polymerase để tổng khối lượng 25 ml. Khuếch đại được tiến hành theo các điều kiện sau đây: biến tính trong 3 phút ở 95ºC, sau đó 35 chu kỳ (30 tuổi ở 95ºC, độ tuổi 30 tại 55ºC và độ tuổi 30 tại 72ºC) và giai đoạn cuối cùng cho 5min ở 72ºC. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di agarose gel trong 1,5 hoặc 3% và hình dung bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Phân tích thông kê số liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± SEM. Sự khác nhau giữa các phương tiện dựa trên t-test. Xác suất <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê