Preliminary DataThis proposal is a

Preliminary Data
This proposal is a collaboration between the PI and Dr. Barry Hurlburt in the Department of Biochemistry and Molecular Biology. The collaboration takes advantage of the expertise of the PI in the molecular genetics of S. aureus and the biochemical expertise of Dr. Hurlburt in transcription factor structure and function (14,15). The overall goals are 1) correlation of the expression of the sarA, sarB and sarC transcripts with the production and activity of SarA, 2) characterization of the mechanism by which sar regulates expression of the S. aureus collagen adhesin gene (cna) and 3) identification and characterization of additional S. aureus genes under the direct regulatory control of SarA. We have assembled all of the experimental tools required to accomplish these objectives. Specifically, we have (i) purified SarA in a form capable of binding an appropriate DNA target, (ii) generated an affinity-purified antibody against purified SarA, (iii) constructed a xylE reporter plasmid that can be used to assess the functional activity of SarA (Specific Aim #1) and define the sequence characteristics required for the regulation of cna transcription (Specific Aim #2), (iv) cloned the regions encoding the sarA, sarB and sarC transcripts for use in complementation experiments, (v) demonstrated that SarA binds a DNA target upstream of cna and begun the process of localizing the SarA binding site and (vi) obtained or generated sar and agr mutants in both cna-positive and cna-negative S. aureus strains. The experiments done to accomplish each of these tasks are described in detail below.

Kết quả (Việt) 1:

Dữ liệu sơ bộĐề xuất này là một sự hợp tác giữa PI và tiến sĩ Barry Hurlburt ở vùng hóa sinh và sinh học phân tử. Sự hợp tác mất lợi thế của chuyên môn của PI di truyền học phân tử của S. aureus và chuyên môn hóa sinh của tiến sĩ Hurlburt trong phiên mã yếu tố cấu trúc và chức năng (14,15). Mục tiêu tổng thể là 1) tương quan của sự biểu hiện của sarA, sarB và sarC bảng điểm với sản xuất và hoạt động của SarA, 2) đặc tính của cơ chế bởi sar mà điều chỉnh các biểu hiện của S. aureus collagen adhesin gen (có thể) và 3) xác định và đặc tính của bổ sung S. aureus gen dưới sự kiểm soát trực tiếp quy định của SarA. Chúng tôi đã tập hợp tất cả các công cụ thử nghiệm cần thiết để đạt các mục tiêu. Cụ thể, chúng tôi khách có (i) tinh khiết SarA trong một hình thức khả năng ràng buộc một mục tiêu thích hợp DNA, (ii) tạo ra một mối quan hệ tinh khiết kháng thể chống lại tinh khiết SarA, (iii) xây dựng một plasmid phóng viên xylE có thể được sử dụng để đánh giá các hoạt động chức năng của SarA (cụ thể mục tiêu #1) và xác định các đặc tính thứ tự yêu cầu cho các quy định có thể phiên mã (cụ thể mục tiêu #2), (iv) nhân bản các vùng mã hóa sarA , sarB và sarC bảng điểm cho sử dụng trong các thí nghiệm complementation, (v) đã chứng minh rằng SarA liên kết với một DNA mục tiêu ở thượng nguồn của có thể và bắt đầu quá trình phối SarA liên kết trang web và (vi) thu được hoặc tạo ra đột biến sar và agr trong cả hai có thể tích cực và tiêu cực có thể S. aureus chủng. Các thí nghiệm được thực hiện để hoàn thành mỗi người trong số các tác vụ này được mô tả chi tiết dưới đây.