ABSTRACT The presence of natural an

ABSTRACT
The presence of natural antioxidant activity in plants has been well acknowledged world wide. There is an increasing demand for natural antioxidants to replace synthetic additives in the food and Pharmacological industries. Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., commonly known as buhi amla, is also one of the traditionally used as medicinal plant. The main goal of this study is to determine the free radical scavenging properties screened for different in vivo and in vitro plant extraction of Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. Free radical scavenging activity was evaluated using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. In vitro callus was induced using internodal explant on MS medium fortified with 2,4-D (0.6 mg/l). The analysis was carried out for in vivo plant and in vitro callus to determine the quantitative phenolic content along with their antioxidant activity of different plant extracts. The result of the present study showed that the methanol extract of Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., contains highest amount of phenolic compounds and exhibits the greatest anti-oxidant activity in comparison to other extracts. It has been observed that, the in vitro plant extract shows more Phenolic contents and revealed better antioxidant activity as compared to in vivo plant extraction.
Keywords: Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., Free radical scavenging activity, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Phenolic compounds


INTRODUCTION
Approximately 80% of the world total population depends exclusively on plants for their health and healing. Recently there has been an upsurge of interest in the therapeutic potential of medicinal plants as antioxidants in reducing such free radical-induced tissue injury[1]. In response to this, increased popularity and greater demand for medicinal plants, a number of conservation groups are recommending that wild medicinal plants be brought into cultivation. All plants produce a diverse range of bioactive molecules, making them a rich source of different types of medicines. A rich heritage of knowledge to preventive and curative medicines was available in ancient scholastic works included in the Atharva veda, Charaka, Sushruta etc[2].Over 50% of all modern clinical drugs are of natural product origin[3] and natural products play an important role in drug development programs in the pharmaceutical industry[4]. Herbal drugs have gained importance in recent years because of their efficacy and cost effectiveness.
Thus, there is an increasing interest in the measurement and use of plant antioxidant for scientific research as well as industrial (dietary, pharmaceutical and cosmetics) purposes. The antioxidants reactions involve multiple steps including the initiation, propagation, branching and termination of free radicals. Free radicals are created when cells use oxygen to generate energy. These by-products are generally reactive oxygen species (ROS) such as super oxide anion, hydroxyl radical and hydrogen peroxide that result from the cellular redox process. At low or moderate concentrations, ROS exert beneficial effects on cellular responses and immune function but at high levels, free radicals and oxidants generate oxidative stress, a deleterious process that can damage cell structures, including lipids, proteins, and DNA[5]. Oxidative stress plays a major part in the development of chronic and degenerative ailments such as cancer, autoimmune disorders, rheumatoid arthritis, cataract, aging, cardiovascular and neurodegenerative diseases[6]. The human body has several mechanisms to counteract oxidative stress by producing antioxidants, which are either naturally produced in situ, or externally supplied through foods. These antioxidants act as free radical scavengers by preventing and repairing damages caused by ROS, and therefore can enhance the immune defense and lower the risk of cancer and other degenerative diseases5. In the continuation of this strategy of new drug discovery, we have studied the plant Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. for their antioxidant activity and phenol content.
Phyllanthus amarus (Schum & Thonn) is an herb belonging to the family Euphorbiaceae and is commonly used in India and are found in other countries including China, Philippines, Cuba, Nigeria and Guam[7]. It is traditionally used in the treatment of malaria-related symptoms, jaundice, constipation, diabetes, flu, kidney ailments, and chronic dysentery, frequent menstruation, ringworm, ulcers, genitourinary tract infections, haemorrhoids, and gonorrhoea, hepatic and urolitic diseases. It is reported to possess antimalarial[8], antiviral[l9], antiplasmodial[10], antibacterial[11], antiinflammatory[12] and antiamnesic activity[13]. It has been employed for treatment of nervous debility, epilepsy and dropsy[14, 15].
An easy, rapid and sensitive method for the antioxidant screening of plant extracts is free radical scavenging assay using 1,1-dipheny l-2picryl hydrazyl (DPPH) stable radical spectrophotometrically[16]. In the presence of an antioxidant, DPPH radical obtains one more electron and the absorbance decreases[17]. In particular, despite widespread use of this plant as medicines all over the globe, the literature contains few reports of antioxidant activity[15]. In present study, we carried out a systematic record of the relative free radical scavenging activity of both in vivo and in vitro models of Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., using different plant extractions. We have also found the relationship of phenol contents with antioxidant activity.
MATERIAL AND METHODS
Chemical used
All the chemicals and growth regulators used are of high analytical grade. 2, 2-Diphenyle-2-picryl hydrazyl (DPPH) from Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA. All solutions were prepared in freshly prepared doubled distilled water. Stock solutions of the test extracts were prepared in methanol, ethanol and Petroleum ether. Appropriate blanks were used for individual assays.
Plant Material
The plant samples i.e. Phyllanthus amarus Schum. and Thonn. were collected from the Botanical Garden, University of Rajasthan, Jaipur. Fresh plant was rinsed severally with clean tap water to make it dust and debris free. Then they were spread evenly and dried in the shady condition for 5 to 6 days, until they become crispy while still retaining the green coloration. Dried plants were ground in electric blender to get fine powder for further use.
Callus induction
The young internodes were picked up and kept under running water for about 15-20 minutes to remove soil particles and then rinsed with liquid detergent (Teepol 1%) (v/v)) for 5-10 minutes. They were then rinsed with sterile double distilled water at least thrice to get rid of teepol. Prior to inoculation, these explants were subsequently surface sterilized in the laminar air flow chamber with 0.1% mercuric chloride (HgCl2 w/v) for 2 minutes, followed by repeated rinsing with sterile double distilled water. The surfaced sterilized explants were finally aseptically inoculated on sterile MS medium[18] comprising 3% sucrose as carbon source and 0.8% agar as solidifying agent. The medium was also supplemented with various growth regulators, which include auxinsLike, 2,4-D, NAA, IAA, IBA in different concentrations(0.2-4.0mg/l). The pH of the media was adjusted to 5.8 before autoclaving. All media were autoclaved at 1.06 kg cm-2 and 121ºC for 15 min. The cultures were incubated in growth room at temperature of 25 ± 2 °C, relative humidity 55 ± 5%, and 16-h photoperiod. 20 replicate cultures were established and each experiment was repeated twice and the cultures were observed at regular intervals.

Kết quả (Việt) 1:

TÓM TẮT Sự hiện diện của chất chống oxy hoá tự nhiên hoạt động trong các nhà máy cũng đã được công nhận trên toàn thế giới. Có là một nhu cầu ngày càng cao về chất chống oxy hóa tự nhiên để thay thế các phụ gia tổng hợp trong thực phẩm và dược các ngành công nghiệp. Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., thường được gọi là buhi amla, cũng là một trong theo truyền thống được sử dụng như là thuốc thực vật. Mục đích chính của nghiên cứu này là để xác định các thuộc tính scavenging gốc tự do chiếu cho thực vật tại vivo và trong ống nghiệm khác nhau khai thác của Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. Gốc tự do scavenging hoạt động được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Trong ống nghiệm callus đã gây ra bằng cách sử dụng internodal explant trên MS trung bình tăng cường với 2,4-D (cách 0.6 mg/l). Các phân tích được thực hiện cho thực vật tại vivo và callus trong ống nghiệm để xác định nội dung phenolic định lượng cùng với hoạt động của chất chống oxy hóa của chất chiết xuất từ thực vật khác nhau. Kết quả của nghiên cứu hiện nay đã chỉ ra rằng các chiết xuất methanol của Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., chứa các số tiền cao nhất của các hợp chất phenolic và trưng bày các hoạt động chống oxy hóa lớn nhất so với các chất chiết xuất từ. Nó đã được quan sát thấy rằng, các chiết xuất thực vật trong ống nghiệm cho thấy nhiều nội dung Phenolic và tiết lộ hoạt động chống oxi hóa tốt hơn so với thực vật tại vivo khai thác. Từ khóa: Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., gốc tự do scavenging hoạt động, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hợp chất Phenolic GIỚI THIỆU Khoảng 80% dân số thế giới tất cả phụ thuộc hoàn toàn vào thực vật cho sức khỏe của họ và chữa bệnh. Gần đây đã có đấm của quan tâm đến tiềm năng điều trị của cây như là chất chống oxy hóa trong việc giảm gốc tự do gây ra mô chấn thương [1]. Trong phản ứng này, tăng cường phổ biến và các nhu cầu lớn hơn cho cây thuốc, một số các nhóm bảo tồn đang đề xuất rằng hoang dã cây thuốc được đưa vào trồng trọt. Tất cả nhà máy sản xuất đa dạng của các phân tử hoạt tính sinh học, làm cho chúng một nguồn phong phú của các loại khác nhau của các loại thuốc. Một di sản phong phú của kiến thức để loại thuốc phòng ngừa và chữa bệnh đã có sẵn trong tác phẩm niên học cổ đại, bao gồm trong Atharva veda, Charaka, Sushruta vv [2].Hơn 50% của tất cả các loại thuốc lâm sàng hiện đại có nguồn gốc tự nhiên sản phẩm [3] và sản phẩm tự nhiên đóng một vai trò quan trọng trong chương trình phát triển ma túy trong ngành công nghiệp dược phẩm [4]. Thuốc thảo dược đã đạt được tầm quan trọng trong năm gần đây vì hiệu quả chi phí và hiệu quả của họ. Thus, there is an increasing interest in the measurement and use of plant antioxidant for scientific research as well as industrial (dietary, pharmaceutical and cosmetics) purposes. The antioxidants reactions involve multiple steps including the initiation, propagation, branching and termination of free radicals. Free radicals are created when cells use oxygen to generate energy. These by-products are generally reactive oxygen species (ROS) such as super oxide anion, hydroxyl radical and hydrogen peroxide that result from the cellular redox process. At low or moderate concentrations, ROS exert beneficial effects on cellular responses and immune function but at high levels, free radicals and oxidants generate oxidative stress, a deleterious process that can damage cell structures, including lipids, proteins, and DNA[5]. Oxidative stress plays a major part in the development of chronic and degenerative ailments such as cancer, autoimmune disorders, rheumatoid arthritis, cataract, aging, cardiovascular and neurodegenerative diseases[6]. The human body has several mechanisms to counteract oxidative stress by producing antioxidants, which are either naturally produced in situ, or externally supplied through foods. These antioxidants act as free radical scavengers by preventing and repairing damages caused by ROS, and therefore can enhance the immune defense and lower the risk of cancer and other degenerative diseases5. In the continuation of this strategy of new drug discovery, we have studied the plant Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. for their antioxidant activity and phenol content. Phyllanthus amarus (Schum & Thonn) là một loại thảo mộc thuộc họ Đại kích và thường được sử dụng ở Ấn Độ và được tìm thấy trong các quốc gia khác bao gồm Trung Quốc, Philippines, Cuba, Nigeria và Guam [7]. Nó theo truyền thống được sử dụng trong điều trị các triệu chứng liên quan đến bệnh sốt rét, vàng da, táo bón, bệnh tiểu đường, bệnh cúm, bệnh thận, và mãn tính bệnh lỵ, thường xuyên kinh nguyệt, bịnh ghe, loét, nhiễm trùng đường hóc-môn sinh, trĩ, và bệnh, hepatic và urolitic bệnh. Đây là báo cáo để có antimalarial [8], kháng virus [l9], antiplasmodial [10], kháng khuẩn [11], kháng viêm [12] và antiamnesic hoạt động [13]. Nó đã được sử dụng để điều trị lo lắng debility, động kinh và chứng thủng nước [14, 15]. Một phương pháp dễ dàng, nhanh chóng và nhạy cảm để kiểm tra chất chống oxy hóa của chất chiết xuất từ thực vật là gốc tự do scavenging khảo nghiệm bằng cách sử dụng 1,1-dipheny l-2picryl hydrazyl (DPPH) ổn định cực đoan spectrophotometrically [16]. Sự hiện diện của một chất chống oxy hoá, DPPH triệt để lấy được một điện tử nhiều hơn và làm giảm hấp thu [17]. Đặc biệt, mặc dù sử dụng rộng rãi của nhà máy này là thuốc trên toàn cầu, các tài liệu chứa vài báo cáo của chất chống oxy hóa hoạt động [15]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi thực hiện có hệ thống diện tích tương đối miễn phí radical scavenging hoạt động của mô hình tại vivo và trong ống nghiệm của Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., bằng cách sử dụng thực vật khác nhau nhổ. Chúng tôi cũng đã tìm thấy mối quan hệ của phenol nội dung với các chất chống oxy hóa hoạt động. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất được sử dụng Tất cả các hóa chất và các cơ quan quản lý sự tăng trưởng được sử dụng là phân tích cao cấp. 2, 2-Diphenyle-2-picryl hydrazyl (DPPH) từ Sigma Aldrich Co., St. Louis, Mỹ. Tất cả các giải pháp đã được chuẩn bị trong nước cất tươi chuẩn bị gấp. Các giải pháp cổ phiếu của các chất chiết xuất từ thử nghiệm đã được chuẩn bị trong methanol, ethanol và dầu khí ête. Mẫu văn bản thích hợp đã được sử dụng cho thử nghiệm cá nhân. Nguyên liệu thực vật Nhà máy ví dụ mẫu Phyllanthus amarus Schum. và Thonn. được thu thập từ các vườn thực vật, đại học Rajasthan, Jaipur. Cây tươi được rửa riêng biệt với vòi nước sạch để làm cho nó bụi và mảnh vỡ miễn phí. Sau đó, họ đã thuần nhất và khô trong điều kiện mờ ám trong 5-6 ngày, cho đến khi họ trở nên giòn trong khi vẫn giữ màu xanh. Cây khô là mặt đất trong máy xay sinh tố điện để có được bột tốt để tiếp tục sử dụng. Callus cảm ứng Gióng trẻ đã được chọn và giữ dưới vòi nước cho khoảng 15-20 phút để loại bỏ các hạt đất và sau đó rinsed với chất tẩy rửa lỏng (Teepol 1%) (v/v)) cho 5-10 phút. Họ sau đó rinsed với vô trùng đôi chưng cất nước tối thiểu ba lần để thoát khỏi của teepol. Trước khi tiêm chủng, các explants sau đó là bề mặt khử trùng trong buồng dòng chảy tầng ép máy với 0,1% mercuric clorua (HgCl2 w/v) cho 2 phút, sau đó là lặp đi lặp lại rửa với vô trùng nước đôi cất. Explants tiệt trùng bề mặt aseptically cuối cùng đã được tiêm chủng trên vô trùng phương tiện MS [18] gồm 3% Sucroza như là nguồn cacbon và 0,8% agar làm kiên cố hóa. Phương tiện truyền thông cũng được bổ sung với các tăng trưởng nhà quản lý, bao gồm auxinsLike, 2,4-D, NAA, IAA, IBA trong concentrations(0.2-4.0mg/l) khác nhau. Độ pH của các phương tiện truyền thông được điều chỉnh để 5.8 trước khi khử trùng. Tất cả các phương tiện truyền thông đã được autoclaved tại 1,06 kg cm-2 và 121ºC trong 15 phút. Các nền văn hóa đã được ủ trong tăng trưởng phòng ở nhiệt độ 25 ± 2 ° C, tương đối độ ẩm 55 ± 5% và 16-h photoperiod. 20 replicate nền văn hóa đã được thiết lập và thử nghiệm mỗi được lặp đi lặp lại hai lần và các nền văn hóa đã được quan sát tại các khoảng thường xuyên.

Kết quả (Việt) 2:

TÓM TẮT
Sự hiện diện của chất chống oxy hóa tự nhiên trong thực vật được cũng thừa nhận trên toàn thế giới. Có một nhu cầu ngày càng cao về chất chống oxy hóa tự nhiên để thay thế các chất phụ gia tổng hợp trong thực phẩm và các ngành công nghiệp dược. Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., Thường được gọi là buhi Amla, cũng là một trong những truyền thống được sử dụng như cây thuốc. Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xác định các thuộc tính nhặt rác gốc tự do được sàng lọc khác nhau trong cơ thể và trong nhổ cây in vitro của Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. Miễn phí hoạt động nhặt rác triệt để được đánh giá sử dụng 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl phương pháp (DPPH). Trong mô sẹo in vitro được cảm ứng bằng cấy internodal trên môi trường MS có bổ sung 2,4 - D (0,6 mg / l). Các phân tích được thực hiện cho máy in vivo và in vitro mô sẹo để xác định các nội dung định lượng phenolic cùng với các hoạt động chống oxy hóa của các chất chiết xuất từ thực vật khác nhau. Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng chiết methanol của Phyllanthus amarus Schum. . & Thonn, chứa lượng cao nhất của các hợp chất phenolic và trưng bày chống lớn nhất - hoạt động oxy hóa so với các chiết xuất khác. Nó đã được quan sát thấy rằng, các nhà máy chiết xuất tinh trong ống nghiệm cho thấy có nhiều nội dung Phenolic và tiết lộ các hoạt động chống oxy hóa tốt hơn so với trong cơ thể chiết xuất thực vật.
Từ khóa: Phyllanthus amarus Schum. . & Thonn, miễn phí hoạt động nhặt rác triệt để, 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl (DPPH), hợp chất phenolic GIỚI THIỆU Khoảng 80% tổng dân số thế giới phụ thuộc hoàn toàn vào các nhà máy đối với sức khỏe và chữa bệnh của họ. Gần đây đã có một sự bùng nổ quan tâm trong khả năng chữa trị của cây thuốc như chất chống oxy hóa trong việc giảm tổn thương mô cực đoan gây ra tự do như vậy [1]. Trong phản ứng này, tăng phổ biến và nhu cầu lớn hơn cho các nhà máy dược, một số nhóm bảo tồn được khuyến cáo là cây thuốc tự nhiên được đưa vào trồng. Tất cả các nhà máy sản xuất một phạm vi đa dạng của các phân tử hoạt tính sinh học, làm cho chúng một nguồn phong phú của các loại khác nhau của các loại thuốc. Một di sản phong phú của kiến thức để các loại thuốc phòng và chữa bệnh đã có sẵn trong các tác phẩm học thuật cổ đại bao gồm trong Atharva Veda, Charaka, Sushruta vv [2] .Over 50% của tất cả các loại thuốc lâm sàng hiện đại có nguồn gốc sản phẩm tự nhiên [3] và các sản phẩm tự nhiên chơi một vai trò quan trọng trong các chương trình phát triển thuốc trong các ngành công nghiệp dược phẩm [4]. Thuốc thảo dược đã trở nên quan trọng trong những năm gần đây vì hiệu quả và hiệu quả chi phí. Do vậy, có một sự quan tâm ngày càng tăng trong việc đo lường và sử dụng các chất chống oxy hóa thực vật đối với nghiên cứu khoa học cũng như công nghiệp (chế độ ăn uống, dược phẩm và mỹ phẩm) mục đích. Các phản ứng chất chống oxy hóa bao gồm nhiều bước bao gồm sự bắt đầu, tuyên truyền, phân nhánh và chấm dứt của các gốc tự do. Các gốc tự do được tạo ra khi các tế bào sử dụng oxy để tạo ra năng lượng. Những sản phẩm phụ thường loài ôxy phản ứng (ROS) như siêu anion oxit, hydroxyl peroxide triệt và hydro là kết quả của quá trình oxy hóa khử tế bào. Ở nồng độ thấp hoặc trung bình, ROS gây tác dụng có lợi trên phản ứng của tế bào và chức năng miễn dịch nhưng ở mức cao, các gốc tự do và oxy hóa tạo ra sự căng thẳng oxy hóa, một quá trình có hại có thể làm hỏng cấu trúc tế bào, bao gồm cả chất béo, protein và DNA [5]. Stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các bệnh mãn tính và thoái hóa như ung thư, rối loạn tự miễn dịch, viêm khớp dạng thấp, đục thủy tinh thể, lão hóa, tim mạch và các bệnh thoái hóa thần kinh [6]. Cơ thể con người có một số cơ chế để chống lại stress oxy hóa bằng cách sản xuất chất chống oxy hóa, đó là một trong hai cách tự nhiên được sản xuất tại chỗ, hoặc bên ngoài cung cấp thông qua các loại thực phẩm. Những chất chống oxy hóa hoạt động nhặt rác triệt để như miễn phí bằng cách ngăn ngừa và sửa chữa thiệt hại do ROS, và do đó có thể tăng cường bảo vệ miễn dịch và giảm nguy cơ ung thư và diseases5 thoái hóa khác. Trong việc tiếp tục chiến lược này của phát minh thuốc mới, chúng tôi đã nghiên cứu các cây Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. cho hoạt động và chất chống oxy hóa phenol của họ. Phyllanthus amarus (Schum & Thonn) là một loại thảo dược thuộc họ Euphorbiaceae và được sử dụng phổ biến ở Ấn Độ và được tìm thấy ở các nước khác như Trung Quốc, Philippines, Cuba, Nigeria và Guam [7]. Nó thường được sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét - liên quan đến các triệu chứng, bệnh vàng da, táo bón, tiểu đường, bệnh cúm, bệnh thận và bệnh lỵ mạn tính, kinh nguyệt thường xuyên, nấm ngoài da, loét, nhiễm trùng đường sinh dục, bệnh trĩ, và bệnh lậu, bệnh gan và các bệnh urolitic. Đây là báo cáo để có sốt rét [8], kháng virus [L9], antiplasmodial [10], kháng khuẩn [11], kháng viêm [12] và antiamnesic hoạt động [13]. Nó đã được sử dụng để điều trị thần kinh suy nhược, bệnh động kinh và cổ chướng [14, 15]. Một phương pháp dễ dàng, nhanh chóng và nhạy cảm đối với việc kiểm tra chất chống oxy hóa của dịch chiết thực vật tự do nhặt rác khảo nghiệm triệt để sử dụng 1,1-dipheny l-2picryl hydrazyl (DPPH ) quang phổ triệt để ổn định [16]. Trong sự hiện diện của một chất chống oxy hóa, DPPH triệt để có được một điện tử nhiều hơn và độ hấp thụ giảm [17]. Đặc biệt, mặc dù sử dụng rộng rãi của loại cây này làm thuốc khắp nơi trên thế giới, các tài liệu có chứa vài báo cáo về hoạt động chống oxy hóa [15]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện một kỷ lục có hệ thống các hoạt động nhặt rác gốc tự do tương đối của cả in vivo và in vitro mô hình của Phyllanthus amarus Schum. & Thonn., Sử dụng chiết thực vật khác nhau. Chúng tôi cũng đã tìm thấy mối quan hệ của nội dung phenol với chất chống oxy hóa hoạt động. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất sử dụng Tất cả các loại hóa chất và phát triển nhà quản lý được sử dụng là loại phân tích cao. 2, 2-Diphenyle-2-picryl hydrazyl (DPPH) từ Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA. Tất cả các giải pháp đã được chuẩn bị chuẩn bị mới tăng gấp đôi nước cất. Các giải pháp chứng khoán của các chất chiết xuất thử nghiệm đã được chuẩn bị trong methanol, ethanol và ether dầu khí. Khoảng trống thích hợp được sử dụng để thử nghiệm cá nhân. Vật liệu thực vật Các mẫu thực vật tức là Phyllanthus amarus Schum. và Thonn. được thu thập từ Vườn Bách thảo Đại học Rajasthan, Jaipur. Cây tươi đã được rửa sạch bằng nước rẽ máy sạch để làm cho nó bụi và mảnh vỡ miễn phí. Sau đó, họ đã được trải đều và sấy khô trong điều kiện râm cho 5-6 ngày, cho đến khi chúng trở nên giòn trong khi vẫn giữ lại màu xanh. Cây khô đã được nghiền trong máy xay điện để có được bột mịn để sử dụng tiếp. Callus cảm ứng Các lóng trẻ đã được nhặt lên và lưu giữ dưới nước sinh hoạt cho khoảng 15 - 20 phút để loại bỏ các hạt đất và sau đó rửa sạch với chất tẩy rửa dạng lỏng (Teepol 1%) ( v / v)) cho 5 - 10 phút. Sau đó, họ đã được rửa bằng nước cất vô trùng kép ít nhất ba lần để thoát khỏi teepol. Trước khi tiêm, các cấy được sau đó khử trùng bề mặt trong buồng luồng không khí laminar với 0,1% clorua thủy ngân (HgCl2 w / v) trong 2 phút, sau đó lặp đi lặp lại rửa bằng nước cất vô trùng kép. Việc cấy được khử trùng bề mặt được cuối cùng vô trùng tiêm vô trùng trên môi trường MS [18] gồm 3% sucrose như nguồn carbon và 0,8% agar làm đại lý củng cố. Môi trường cũng đã được bổ sung chất điều hòa tăng trưởng khác nhau, trong đó bao gồm auxinsLike, 2,4 - D, NAA, IAA, IBA ở nồng độ khác nhau (0,2 - 4.0mg / l). Độ pH của các phương tiện truyền thông đã được điều chỉnh lên 5,8 trước khi hấp. Tất cả phương tiện truyền thông đã được hấp ở 1,06 kg cm - 2 và 121 º C trong 15 phút. Các nền văn hóa được ủ trong phòng tăng trưởng ở nhiệt độ 25 ± 2 ° C, độ ẩm tương đối 55 ± 5%, và 16 - h chiếu sáng. 20 nền văn hóa lặp lại được thành lập và mỗi thí nghiệm được lặp lại hai lần và các nền văn hóa đã được quan sát đều ​​đặn.