.2
 Detection of Antigen-spe

.2
 Detection of Antigen-specific T Cells
It is indisputable that improvement of vaccination strategies often requires stronger in vivo induction of antigen-specific effector and memory T cells or, for therapeutic vaccination, modulation of already existing antigen-specific T cell populations. In- deed, many vaccination protocols and reagents have been developed over the past decades with the specific goal of improving T cell immunogenicity. However, im- provement of T cell-based vaccination is dependent on accurate monitoring of the success of Tcell vaccination and correlation of vaccine-induced Tcell status with the quality of protection. The presence and frequencies of antigen-specific Tcells in vivo can be detected by ‘function-dependent’ and ‘function-independent’ methods. Until recently, the limit- ing dilution assay (LDA) was the only technique available for determination of anti- gen-specific Tcell frequencies [4]. LDA is based on sequential dilution andin vitro ex- pansion of cell samples in 96-well plates, followed by functional assays (such as pro- liferation or cytotoxicity assays) to ascertain the number of wells containing antigen- specific cell lines or clones. Recent studies using more advanced methods for ex vivo T cell analysis demonstrated that the numbers obtained by LDA assays often sub- stantially underestimated the true in vivo T cell frequencies [5–7]. The development of assays that require only very brief in vitro restimulation, such as the enzyme- linked immunospot assay (ELISPOT) [8] and intracellular cytokine staining [5], con- siderably improved determination of T cell frequencies (Figures 5.1 and 5.2). In these assay systems, T cells responding specifically to antigen are detected through their ability to rapidly produce effector cytokines such as IFN , TNF , IL-2, or IL-4. Cytokine capture is achieved by using an affinity matrix,which can be established ex- tracellularly (e.g., by using nitrocellulose, ELISPOT) or on the cell surface (a so- called cytokine capture assay, CCA [9]). Another method, intracellular cytokine stain- ing (ICS), is based on accumulation of cytokines within the cell by blocking the se- cretion apparatus (e.g., in the presence of brefeldin A or monensin) and subsequent intracellular staining for the cytokine of interest (Figure 5.1). All these assays have proven to be very sensitive, allowing ex vivo detection of antigen-specific Tcell popu- lations with frequencies as low as 0.02%. One advantage of the ELISPOT assay is that relatively little cell material is needed in comparison to flow cytometry-based de- tection systems (CCA, ICS). However, flow cytometry allows simultaneous staining of different cytokines and surface antigens, providing a more precise phenotypic analysis of the responding cell populations. Multiparameter ELISPOTassays have re- cently been developed to compensate for some of the limitations of this method [10]. The CCA keeps cells alive, and its combination with cell separation techniques such as FACS or sorting with paramagnetic beads allows purification of antigen-specific Tcells for further analysis of the cell population. All these assays detect antigen-spe- cific Tcells based on an effector function – rapid production of cytokines in response to in vitro restimulation with antigen. Only T cells capable of responding with the readout effector function under the chosen in vitro restimulation conditions are de- tected. Because antigen-specific T cell populations under in vivo conditions seem t

Kết quả (Việt) 1:

.2 phát hiện tế bào kháng nguyên cụ thể TNó là không thể chối cãi rằng cải thiện chiến lược tiêm chủng thường đòi hỏi mạnh mẽ hơn cảm ứng tại vivo effector kháng nguyên cụ thể và các tế bào bộ nhớ T, hoặc tiêm phòng điều trị, điều chế đã hiện có dân số tế bào T kháng nguyên cụ thể. Trong chứng thư, nhiều giao thức tiêm phòng và thuốc thử đã được phát triển trong những thập kỷ qua với mục tiêu cụ thể của việc cải thiện các tế bào T immunogenicity. Tuy nhiên, im-provement của tế bào T-dựa tiêm phòng là phụ thuộc vào chính xác giám sát của sự thành công của tiêm chủng Tcell và tương quan của thuốc chủng gây ra tình trạng Tcell với chất lượng bảo vệ. Sự hiện diện và tần số cụ thể kháng nguyên Tcells tại vivo có thể được phát hiện bởi 'phụ thuộc vào chức năng' và 'chức năng độc lập' phương pháp. Cho đến gần đây, khảo nghiệm pha loãng giới hạn-ing (cấp LDA Cải) là phương pháp duy nhất có sẵn để xác định tần số cụ thể chống-gen Tcell [4]. Cấp LDA Cải dựa trên trình tự pha loãng andin ống nghiệm cũ-pansion của tế bào mẫu trong 96-cũng tấm, theo sau các thử nghiệm chức năng (chẳng hạn như thử nghiệm chuyên nghiệp-liferation hoặc cytotoxicity) để xác định số lượng giếng có chứa di động cụ thể kháng nguyên dòng hoặc dòng vô tính. Nghiên cứu gần đây bằng cách sử dụng phương pháp tiên tiến hơn, cho ex vivo T di động phân tích chứng minh rằng những con số thu được bằng cấp LDA Cải thí thường phụ stantially đánh giá thấp tần số tế bào T tại vivo đúng [5-7]. Sự phát triển của thử nghiệm yêu cầu chỉ rất ngắn restimulation trong ống nghiệm, chẳng hạn như các enzym - liên kết immunospot khảo nghiệm (ELISPOT) [8] và nội bào cytokine nhuộm [5], con-siderably cải thiện xác định tần số tế bào T (con số 5.1 và 5.2). Trong các hệ thống này khảo nghiệm, tế bào T trả lời cụ thể kháng nguyên được phát hiện thông qua khả năng của mình để nhanh chóng sản xuất phân bào effector như IFN, TNF, IL-2, hoặc IL-4. Cytokine chụp đạt được bằng cách sử dụng một ma trận ái lực, có thể là thành lập ex-tracellularly (ví dụ, bằng cách sử dụng nitrocellulose, ELISPOT) hoặc trên bề mặt tế bào (một rất - cytokine được gọi là chụp khảo nghiệm, CCA [9]). Một phương pháp, nội bào cytokine vết-ing (ICS), dựa trên sự tích tụ của các phân bào trong tế bào bằng cách ngăn chặn các bộ máy se-cretion (ví dụ, sự hiện diện của brefeldin A hoặc monensin) và sau đó nội bào nhuộm cho cytokine quan tâm (hình 5.1). Tất cả các thử nghiệm đã chứng minh là rất nhạy cảm, cho phép cũ vivo phát hiện của kháng nguyên cụ thể Tcell popu-lations với tần số thấp nhất là 0,02%. Một lợi thế của các khảo nghiệm ELISPOT là tương đối ít di động vật liệu cần so với lưu lượng hệ thống dựa trên cytometry de tection (CCA, ICS). Tuy nhiên, dòng chảy cytometry cho phép đồng thời nhuộm khác nhau phân bào và kháng nguyên bề mặt, cung cấp một phân tích chính xác hơn kiểu hình của quần thể tế bào responding. Multiparameter ELISPOTassays đã re-giao được phát triển để bù đắp cho một số hạn chế của phương pháp này [10]. CCA giữ các tế bào sống, và sự kết hợp với các tế bào phân chia kỹ thuật chẳng hạn như FACS hoặc phân loại với thuận từ hạt cho phép thanh lọc của kháng nguyên cụ thể Tcells để tiếp tục phân tích của dân số di động. Tất cả các thử nghiệm phát hiện kháng nguyên-spe-cific Tcells dựa trên một chức năng effector-nhanh chóng sản xuất phân bào trong phản ứng để restimulation trong ống nghiệm với kháng nguyên. Tế bào T duy nhất có khả năng đáp ứng với chức năng effector readout trong điều kiện restimulation trong ống nghiệm được lựa chọn là de-tected. Bởi vì quần thể kháng nguyên cụ thể T tế bào dưới điều kiện tại vivo có vẻ t

Kết quả (Việt) 2:

0,2 ??????? Phát hiện của các tế bào T kháng nguyên cụ thể
là không thể chối cãi rằng cải thiện các chiến lược tiêm chủng thường đòi hỏi mạnh mẽ hơn trong cảm ứng in vivo của effector và bộ nhớ tế bào T đặc hiệu kháng nguyên hay, tiêm phòng trị liệu, điều chế các quần thể tế bào T đặc hiệu kháng nguyên đã có. Hành In-, nhiều giao thức tiêm và thuốc thử đã được phát triển trong thập kỷ qua, với mục tiêu cụ thể của việc cải thiện tế bào T miễn dịch. Tuy nhiên, sự cải thiện của T tiêm tế bào cơ bản là phụ thuộc vào giám sát chính xác về sự thành công của tiêm chủng Tcell và mối tương quan của tình trạng Tcell vaccine gây ra với chất lượng bảo vệ. Sự hiện diện và tần số của Tcells đặc hiệu kháng nguyên trong cơ thể có thể được phát hiện bằng phương pháp 'chức năng độc lập' 'chức năng phụ thuộc vào' và. Cho đến gần đây, các limit- pha loãng ing khảo nghiệm (LDA) là kỹ thuật duy nhất có sẵn để xác định tần số Tcell gen cụ thể chống [4]. LDA được dựa trên sự pha loãng liên tiếp andin vitro Thí Pansion mẫu tế bào trong đĩa 96 giếng, tiếp theo là các xét nghiệm chức năng (như trình liferation hoặc gây độc tế bào xét nghiệm) để xác định số lượng các giếng chứa antigen- dòng tế bào cụ thể hay bắt chước. Các nghiên cứu gần đây sử dụng phương pháp tiên tiến hơn cho ex vivo phân tích tế bào T đã chứng minh rằng những con số thu được bằng xét nghiệm LDA thường phụ hướng bền vững thực sự đánh giá thấp trong cơ thể tần số tế bào T [5-7]. Sự phát triển của những xét nghiệm mà chỉ đòi hỏi rất ngắn gọn trong ống nghiệm restimulation, chẳng hạn như các xét nghiệm enzyme liên kết immunospot (ELISpot) [8] và trong tế bào cytokine nhuộm [5], con- quyết siderably cải thiện tần số tế bào T (Hình 5.1 và 5.2) . Trong các hệ thống khảo nghiệm, các tế bào T đáp ứng kháng nguyên đặc biệt để phát hiện qua khả năng của mình để nhanh chóng tạo ra các cytokine effector như IFN, TNF, IL-2, hay IL-4. Chụp Cytokine là đạt được bằng cách sử dụng một ma trận ái lực, có thể được thành lập Thí tracellularly (ví dụ, bằng cách sử dụng nitrocellulose, ELISpot) hoặc trên bề mặt tế bào (một cái gọi là chụp cytokine khảo nghiệm, CCA [9]). Một phương pháp khác, cytokine nội bào ing stain- (ICS), dựa trên sự tích tụ của các cytokine trong tế bào bằng cách ngăn chặn các bộ máy cretion se- (ví dụ, trong sự hiện diện của brefeldin A hoặc Monensin) và nhuộm tế bào tiếp theo đối với các cytokine quan tâm ( Hình 5.1). Tất cả các xét nghiệm đã được chứng minh là rất nhạy cảm, cho phép ex vivo phát hiện kháng nguyên đặc hiệu Tcell qui cư với tần số thấp 0,02%. Một lợi thế của việc khảo nghiệm ELISpot là nguyên liệu tế bào tương đối ít là cần thiết so với đo dòng tế bào dựa trên hệ thống sự bảo triển (CCA, ICS). Tuy nhiên, đo dòng tế bào cho phép nhuộm đồng thời của các cytokine khác nhau và kháng nguyên bề mặt, cung cấp một phân tích kiểu hình chính xác hơn của các quần thể tế bào đáp ứng. ELISPOTassays đa thông đã tái cently được phát triển để bù đắp cho một số hạn chế của phương pháp này [10]. CCA giữ các tế bào sống, và sự kết hợp với các kỹ thuật tách tế bào như FACS hoặc phân loại với hạt thuận cho phép thanh tẩy của Tcells kháng nguyên cụ thể để phân tích thêm các quần thể tế bào. Tất cả các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên-Tcells cific biệt dựa trên một chức năng effector - sản xuất nhanh chóng của các cytokine trong phản ứng để in vitro restimulation với kháng nguyên. Chỉ có các tế bào T có khả năng đáp ứng với các chức năng đọc số effector dưới chọn trong điều kiện restimulation ống nghiệm là de- tected. Bởi vì quần thể tế bào T đặc hiệu kháng nguyên trong cơ thể dưới điều kiện có vẻ t