ground in an equal volume of PCR bu

ground in an equal volume of PCR buffer (Tris -
HCL 200 txM, pH 7.5; NaC1, 250 ixM; EDTA, 25
IzM; and SDS, 0.5%); the debris removed by brief
centrifugation (1 min, 14 000 x g) and DNA precipitated
by addition of an equal volume of isopropanol
at room temperature for 5 rain. DNA
was pelleted by centrifugation (10 rain, 14 000 x
g) and resuspended in 100 ~1 of 10 mM Tris. HCI
and 1 mM EDTA solution, pH 8.
3.4. PCR amplification with target primers
Primers CgInt (GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG)
and ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)
[9] were supplied by Operon Technologies
Inc., California. PCR reaction mixtures (100
/xl) contained 10 txl fungal DNA (approx. 50 ng),
10 /xl 10 X Taq buffer, 0.5 #I (2.5 U) Taq DNA
polymerase (Promega), 200 #M each of dATP,
dCTP, dGTP and dTTP (16 tzl), 1 /xM each (5/xl
each) of Cglnt and ITS4 and 53.5 p~l of sterile
distilled water. Mixtures were subjected to 30
cycles of 1.5 min at 94°C, 2 min at 45°C and 3 min
at 72°C on a programmable thermal cycler (Hybald).

3.5. PCR amph'fication with random primers
Synthetic oligonucleotides (10-mers; kits A and
B) supplied by Operon were used for RAPD
analysis. A typical 100-#1 reaction contained 10
txl of a single primer (15 /xg ml i stock) and all
other components as described above. An annealing
temperature of 30°C and 45 amplification
cycles were adopted, preceded by 7 rain denaturation
at 94°C and followed by 7 min extension at
72°C. The following six primers were used: A3
(AGTCAGCCAC); All (CAATCGCCGT); A18
(AGGTGACCGT); B6 (TGCTCTGCCC); B8
(GTCCACACGG); and B10 (CTGCTGGGAC).
PCR products (10-15 txl) were analysed following
etectrophoresis in 1.4% (w/v) agarose gels
containing ethidium bromide (0.4 txg ml 1) by
viewing on a transilluminator.
3.6. Southern blotting, probe preparation, hybridisation
and autoradiography
PCR products were transferred, following
electrophoresis, to nylon membranes, (Hybond N,
Amersham) by capillary transfer [8]. A PCR

Kết quả (Việt) 1:

mặt đất trong một khối lượng bằng nhau của Đảng Cộng sản Romania đệm (Tris-HCL 200 txM, pH 7,5; NaC1, 250 ixM; EDTA, 25IzM; và dùng mũi SDS, 0,5%); các mảnh vỡ gỡ bỏ bằng cách giới thiệu tóm tắtsố (1 min, 14 000 x g) và ADN kết tủabằng cách thêm một lượng bằng nhau của isopropanolở nhiệt độ phòng cho 5 mưa. DNAđược pelleted bởi số (10 mưa, 14 000 xg) và resuspended trong 100 ~ 1 của 10 mM Tris. HCIvà giải pháp EDTA 1 mM, độ pH 8.3.4. PCR khuếch đại với mục tiêu chất mồiChất nền, mồi CgInt (GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG)và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)[9] đã được cung cấp bởi công nghệ OperonInc (California). Đảng Cộng sản Romania phản ứng hỗn hợp (100/ xl) chứa 10 txl nấm DNA (khoảng 50 ng),10 /xl 10 X Taq đệm, cách 0.5 #I (2,5 U) Taq DNApolymerase (Promega), 200 mỗi #M của dATP,dCTP, dGTP và dTTP (16 tzl), 1 /xM mỗi (5/xlmỗi) của Cglnt và ITS4 và 53,5 p ~ l của vô trùngnước cất. Hỗn hợp đã phải chịu đến 30chu kỳ của 1.5 phút tại 94° C, 2 phút 45° c và 3 phútở 72° C trên một lập trình nhiệt người đạp xe máy (Hybald).3.5. PCR amph'fication với lớp lót ngẫu nhiênTổng hợp oligonucleotides (10-mers; bộ dụng cụ A vàB) được cung cấp bởi Operon đã được sử dụng cho RAPDphân tích. Một phản ứng điển hình 100-#1 chứa 10TXL một mồi duy nhất (15 /xg ml tôi cổ) và tất cảthành phần khác như mô tả ở trên. Một ủnhiệt độ 30° C và 45 khuếch đạichu kỳ đã được thông qua, trước bởi 7 mưa denaturationtại 94° C và theo sau là phần mở rộng 7 phút tại72° C. Lớp lót sáu sau đây đã được sử dụng: A3(AGTCAGCCAC); Tất cả (CAATCGCCGT); A18 XA LỘ(AGGTGACCGT); B6 (TGCTCTGCCC); B8(GTCCACACGG); và B10 (CTGCTGGGAC).Đảng Cộng sản Romania sản phẩm (10-15 txl) đã phân tích sau đâyetectrophoresis trong 1,4% (w/v) agarose gelcó ethidium bromua (cách 0.4 txg ml 1) bởixem trên một transilluminator.3.6. Nam thấm, chuẩn bị thăm dò, laivà autoradiographyĐảng Cộng sản Romania sản phẩm đã được chuyển giao, sauđiện, để màng nylon, (Hybond N,Amersham) bởi mao mạch chuyển [8]. MỘT ĐẢNG CỘNG SẢN ROMANIA

Kết quả (Việt) 2:

mặt đất trong một lượng bằng nhau của bộ đệm PCR (Tris -
HCL 200 TXM, pH 7,5; NaC1, 250 ixM; EDTA, 25
IZM; và SDS, 0,5%); các mảnh vỡ loại bỏ bằng cách ngắn gọn
ly tâm (1 phút, 14 000 xg) và DNA kết tủa
bằng cách thêm một lượng bằng nhau của isopropanol
ở nhiệt độ phòng cho 5 mưa. DNA
được ăn viên bằng cách ly tâm (10 mưa, 14 x 000
g) và lơ lửng trong 100 ~ 1 của 10 mM Tris. HCI
và 1 giải pháp mM EDTA, pH 8.
3.4. Khuếch đại với cặp mồi PCR mục tiêu
mồi CgInt (GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG)
và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)
[9] đã được cung cấp bởi operon Technologies
Inc., California. Hỗn hợp phản ứng PCR (100
/ xl) chứa 10 TXL DNA nấm (approx. 50 ng),
10 / xl 10 X Taq đệm, 0,5 #I (2,5 U) Taq DNA
polymerase (Promega), 200 #p mỗi dATP,
dCTP , dGTP và dTTP (16 tzl), 1 / xM mỗi (5 / xl
mỗi nhóm) Cglnt và ITS4 và 53,5 p ~ l của vô trùng
nước cất. Hỗn hợp đã phải chịu 30
chu kỳ là 1,5 phút ở 94 ° C, 2 phút ở 45 ° C và 3 phút
ở 72 ° C, trong một chu trình nhiệt lập trình (Hybald). 3.5. Amph'fication PCR với mồi ngẫu nhiên oligonucleotide tổng hợp (10-Mers, bộ dụng cụ A và B) được cung cấp bởi operon được sử dụng cho RAPD phân tích. Một điển hình 100- # 1 phản ứng chứa 10 TXL của mồi duy nhất (15 / xg ml i cổ phiếu) và tất cả các thành phần khác như mô tả ở trên. Một ủ nhiệt độ 30 ° C và 45 khuếch đại chu kỳ đã được thông qua, trước bởi 7 mưa biến tính ở 94 ° C và theo sau 7 phút mở rộng tại 72 ° C. Sáu mồi sau đây được sử dụng: A3 (AGTCAGCCAC); Tất cả (CAATCGCCGT); A18 (AGGTGACCGT); B6 (TGCTCTGCCC); B8 (GTCCACACGG); và B10 (CTGCTGGGAC). sản phẩm PCR (10-15 TXL) được phân tích sau đây etectrophoresis trong 1,4% (w / v) gel agarose có chứa ethidium bromide (0,4 txg ml 1) bằng cách xem trên transilluminator. 3.6. Blotting miền Nam, chuẩn bị đầu dò, lai giống và autoradiography sản phẩm PCR đã được chuyển giao, sau điện, với màng nylon, (Hybond N, Amersham) bằng chuyển mao [8]. Một PCR