Fig. 1. The speci¢c detection of G.

Fig. 1. The speci¢c detection of G. margarita MAFF520054 and CK. Lane 1, PX174 HaeIII fragments; lane 2, MAFF520054 ; lanes 3^5, CK; lane 6, Ni-A; lane 7, MAFF520052. a: PCR with primers, M13 mini-satellite and 639R. b: Southern hybridization with 230PBC. That one of the DNA prepa- rations from G. margarita CK (lane 4) did not act as the template for PCR was con¢rmed with the ITS1 and ITS4 primer set.


(Amersham Pharmacia Biotech). DNA sequences were de- termined with ABI Prism Big Dye Terminator cycle se- quencing ready reaction kit and ABI 310 DNA sequencer (PE Biosystems) in the Center for Gene Research of Ya- maguchi University.

2.5.Southern hybridization

The oligonucleotide was labeled by ECL 3P-oligo label- ing kit (Amersham Pharmacia Biotech). After electropho- resis, PCR products were transferred to a piece of Hybond Nþ membrane by capillary action. Detection of positive signals was according to ECL 3P-oligo detection kit. The probe was hybridized at 56‡C for 2^5 h, then washed twice in 0.1USSC/0.1% SDS at 60‡C for 20 min. Other condi- tions were according to the supplier’s manual. The DIG
oligonucleotide tailing kit and DIG luminescent detection kit (Roche Diagnostics), respectively, were used in place of the probing and detecting kit in the experiments on DNA preparations from plant roots.


3.Results and discussion

Of 13 PCR primers tested, 639R (5P-TAC CTA ATG

CCA AGA TGA C-3P) produced a 235-bp band speci¢c for G. margarita MAFF520054 and CK in combination with the M13 mini-satellite primer (Fig. 1a). This primer set did not produce bands from DNA preparations other than these isolates. Other primer sets tested did not am- plify such a product (data not shown). The results were reproducible with the DNA preparations of di¡erent spores of each isolate. The DNA sequence diagnostic for
G. margarita MAFF520054 and CK was deposited in the GenBank/EMBL/DDBJ databases (accession number AB052750). The sequence of the diagnostic product was searched for homology by the FASTA program in the EMBL/GenBank/DDBJ databases. We chose an area that had rarely matched with the published sequences for designing an oligonucleotide probe, 230PBC (5P-CTA ACC ATT TAT CGC ATT TTT CGC AGT AGC GAG TGT ATT GCC AAG-3P). The probe, 230PBC, hybrid- ized only with the PCR products from both G. margarita MAFF520054 and CK (Fig. 1b). No PCR product posi- tively reacting with the probe was obtained from the DNA of the other isolates tested even in di¡erent sizes. The same was true for the other fungi tested (data not shown). We tested the e⁄ciency of the protocol to detect the hyphal DNA of G. margarita MAFF520054 in plant roots. The semi-nested PCR clearly detected the AMF colonizing in




Fig. 2. The isolate-speci¢c detection of G. margarita MAFF520054 in AMF-colonized plant roots. a: AMF DNA in the preparations from plant roots was detected by the semi-nested PCR with the primer set of VANS1 and AM1-2 followed by VANS1 and NS21. b: A portion of each preparation shown in panel a was subjected to ampli¢cation with the primer set of M13 mini-satellite and 639R followed by probing with 230PBC. Lane 1, PX174/ HaeIII digest; lane 2, negative control; lane 3, G. margarita MAFF520054 sporal DNA; lanes 4, 5, onion roots colonized by G. margarita MAFF520054 ; lanes 6, 7, onion leaves colonized by G. margarita MAFF520054 ; lanes 8, 9, bahia grass and white clover roots colonized by G. marga- rita sp. Ni-A; lanes 10, 11, bahia grass and white clover roots colonized by G. margarita MAFF520052 ; lanes 12, 13, bahia grass and white clover roots colonized by G. rosea MAFF520062 ; lane 14, PX174/HaeIII digest.



Fig. 3. The distribution of the loci homologous to eucaryotic satellite se- quences.



roots (Fig. 2a). Among the preparations containing fungal DNA, the primer set ampli¢ed the diagnostic sequence only from onion roots colonized by G. margarita MAFF520054 (Fig. 2b).
This is the ¢rst study on the isolate-speci¢c identi¢ca- tion of G. margarita by using a single DNA sequence as a diagnostic molecular marker. By focusing on the sequence, we could deal with not only spores (Fig. 1) but also plant roots colonized by the AMF of interest (Fig. 2). This may have a great advantage in ecological studies of AMF in- troduced into the environment compared to methods based on the polymorphism of PCR products. Recently, the isolate-speci¢c identi¢cation of Glomus sp. from plant roots was carried out by means of single-stranded confor- mation polymorphisms of PCR products from the D2 re- gion of the large subunit rRNA gene [17]. As in the case of ITSs, the intra-isolate variation of the D2 sequences low- ered the speci¢city of the sequence as a molecular marker for a Gl. coronatus isolate [8]. For tracing the fate of
G. margarita CK in environments, in contrast, the detec- tion of the diagnostic sequence is a quite simple and reli- able method.
We examined the relationship of the sequence to the highly repe

Kết quả (Việt) 1:

Hình 1. Speci ¢ c phát hiện G. margarita MAFF520054 và CK. Lane 1, PX174 HaeIII mảnh; Lane 2, MAFF520054; làn xe 3 ^ 5, CK; Lane 6, Ni-A; Lane 7, MAFF520052. a: PCR với lớp lót, M13 mini-truyền hình vệ tinh và 639R. b: Nam lai giống với 230PBC. Là một trong những ADN prepa-khẩu phần từ G. margarita CK (lane 4) không hành động như khuôn mẫu cho PCR là côn ¢ rmed cùng với ITS1 và ITS4 mồi.(Amersham Pharmacia công nghệ sinh học). Trình tự ADN đã de-termined với ABI lăng kính lớn thuốc nhuộm Terminator chu se-quencing đã sẵn sàng phản ứng kit và ABI 310 DNA sequencer (PE Biosystems) tại Trung tâm nghiên cứu Gene của Ya-maguchi trường đại học.2.5.Southern laiOligonucleotide đã được dán nhãn bởi ECL 3P-oligo nhãn-ing kit (Amersham Pharmacia công nghệ sinh học). Sau electropho-resis, sản phẩm PCR được chuyển sang một mảnh Hybond Nþ màng bằng hành động mao mạch. Phát hiện tín hiệu tích cực đã theo ECL 3P-oligo phát hiện kit. Các thăm dò được cặp tại 56‡C cho 2 ^ h 5, sau đó rửa sạch hai lần trong 0.1USSC/0.1% SDS tại 60‡C cho 20 phút. Khác condi-tions theo hướng dẫn của nhà cung cấp. ĐÀOoligonucleotide tailing kit và ĐÀO huỳnh quang phát hiện kit (Roche Diagnostics), tương ứng, được sử dụng thay cho kit thăm dò và phát hiện trong các thí nghiệm trên ADN chuẩn bị từ rễ cây.3. kết quả và thảo luậnSố 13 PCR chất nền, mồi thử nghiệm, 639R (5P-TAC CTA ATGCCA AGA TGA C - 3 P) sản xuất một ban nhạc 235-bp speci ¢ c cho G. margarita MAFF520054 và CK kết hợp với truyền hình vệ mini-tinh M13 mồi (hình 1a). Điều này đặt mồi không sản xuất băng từ DNA chế phẩm khác hơn so với những chủng. Bộ mồi khác thử nghiệm đã không am-plify một sản phẩm như vậy (dữ liệu không hiển thị). Kết quả là thể sanh sản nhiều với chế phẩm DNA của di¡erent bào tử của mỗi isolate. Trình tự ADN chẩn đoán choG. margarita MAFF520054 và CK được lắng đọng trong cơ sở dữ liệu EMBL-GenBank-DDBJ (gia nhập số AB052750). Trình tự của các sản phẩm chuẩn đoán tìm kiếm tính tương đồng bởi chương trình FASTA trong cơ sở dữ liệu GenBank-EMBL-DDBJ. Chúng tôi đã chọn một khu vực mà hiếm khi có phù hợp với các chuỗi được xuất bản cho việc thiết kế một thăm dò oligonucleotide, 230PBC (5P-CTA ACC ATT TAT CGC ATT TTT CGC AGT AGC GAG TGT ATT GCC AAG - 3P). Thăm dò, 230PBC lai-ized chỉ với các sản phẩm PCR từ cả hai margarita G. MAFF520054 và CK (hình 1b). Không có Đảng Cộng sản Romania sản phẩm posi-cách phản ứng với các thăm dò nhận được từ DNA của các chủng thử nghiệm ngay cả trong các kích thước di¡erent. Cùng là đúng đối với các loại nấm khác thử nghiệm (dữ liệu không hiển thị). Chúng tôi thử nghiệm e⁄ciency của giao thức để phát hiện ADN G. che margarita MAFF520054 tại rễ cây. Bán lồng PCR rõ ràng phát hiện AMF đổ trongHình 2. Isolate – speci ¢ c phát hiện G. margarita MAFF520054 ở rễ cây AMF thuộc địa. a: AMF DNA trong các chế phẩm từ rễ cây được phát hiện bởi PCR bán lồng cùng với mồi của VANS1 và AM1-2 theo sau là VANS1 và NS21. b: một phần của mỗi chuẩn bị hiển thị trong bảng điều khiển một được chịu các ampli ¢ cation cùng với mồi của vệ mini-tinh M13 và 639R theo thăm dò với 230PBC. Lane 1, PX174 / HaeIII tiêu hóa; Lane 2, kiểm soát tiêu cực; Lane 3, G. margarita MAFF520054 sporal DNA; làn xe 4, 5, nguồn gốc củ hành thuộc địa của G. margarita MAFF520054; làn đường 6, 7, hành lá thuộc địa của G. margarita MAFF520054; làn đường 8, 9, bahia cỏ và cỏ ba lá trắng rễ thuộc địa của G. marga-rita sp. Ni-A; làn đường 10, 11, bahia cỏ và cỏ ba lá trắng rễ thuộc địa của G. margarita MAFF520052; làn đường 12, 13, bahia cỏ và cỏ ba lá trắng rễ thuộc địa của G. rosea MAFF520062; Lane 14, PX174/HaeIII tiêu hóa.Hình 3. Phân phối loci tương đồng với truyền hình vệ tinh eucaryotic se-quences.rễ (hình 2a). Trong số các chế phẩm có chứa nấm DNA, mồi đặt ampli ¢ ed trình tự chẩn đoán chỉ từ gốc rễ củ hành thuộc địa của G. margarita MAFF520054 (hình 2b).Đây là nghiên cứu isolate – speci ¢ c identi ¢ ca-tion của G. margarita ¢ rst bằng cách sử dụng một trình tự DNA duy nhất như là một dấu hiệu chẩn đoán phân tử. Bằng cách tập trung vào các chuỗi, chúng tôi có thể đối phó với không chỉ là bào tử (hình 1) nhưng cũng là rễ cây thuộc địa của AMF quan tâm (hình 2). Điều này có thể có một lợi thế rất lớn trong các nghiên cứu sinh thái của AMF trong-troduced vào môi trường so với phương pháp dựa trên đa hình của sản phẩm PCR. Gần đây, isolate – speci ¢ c identi ¢ cation của Glomus sp. từ rễ cây được thực hiện bằng đơn-stranded confor-mation polymorphisms của các sản phẩm PCR D2 re-gion của tiểu đơn vị lớn rRNA gene [17]. Như trong trường hợp của ITSs, các biến thể nội isolate của D2 trình tự thấp-ered thành phố trình tự như một điểm đánh dấu phân tử cho Gl. coronatus speci ¢ cô lập [8]. Đối với truy tìm số phậnG. margarita CK trong môi trường, ngược lại, detec-tion của trình tự chẩn đoán là khá đơn giản và reli - thể phương pháp.Chúng tôi kiểm tra các mối quan hệ của trình tự để cao ngh

Kết quả (Việt) 2:

Sung. 1. Các cụ thể phát hiện ¢ c G. margarita MAFF520054 và CK. Ngõ 1, các mảnh PX174 HaeIII; ngõ 2, MAFF520054; làn 3 ^ 5, CK; ngõ 6, Ni-A; ngõ 7, MAFF520052. a: PCR với mồi, M13 mini-vệ tinh và 639R. b: lai Southern với 230PBC. Đó là một trong những khẩu phần DNA prepa- từ G. margarita CK (ngõ 4) đã không hành động như một khuôn mẫu cho PCR là ¢ con rmed với ITS1 và ITS4 mồi bộ.


(Amersham Pharmacia Biotech). Trình tự DNA triển termined với ABI Prism Big Dye Terminator chu se- quencing sẵn sàng kit phản ứng và ABI 310 sequencer DNA (PE Biosystems) tại Trung tâm nghiên cứu gen của Đại học Ya- maguchi.

Lai 2.5.Southern

Các oligonucleotide được dán nhãn của ECL 3P-oligo label- bộ ing (Amersham Pharmacia Biotech). Sau resis electropho-, sản phẩm PCR đã được chuyển giao cho một mảnh Hybond NTH màng bởi hành động mao dẫn. Phát hiện tín hiệu tích cực đã được theo ECL kit phát hiện 3P-oligo. Các thăm dò đã được lai ghép tại 56 ‡ C trong 2 ^ 5 h, sau đó rửa sạch hai lần trong 0.1USSC / 0,1% SDS 60 ‡ C trong 20 phút. Các điều kiện khác là theo nhãn hiệu của nhà cung cấp. Các DIG
bộ oligonucleotide tailing và DIG kit phát hiện phát quang (Roche Diagnostics), tương ứng, đã được sử dụng ở vị trí của bộ thăm dò và phát hiện trong các thí nghiệm của các sản phẩm DNA từ rễ cây.


3.Results và thảo luận

Trong số 13 cặp mồi PCR kiểm tra, 639R ( 5P-TAC CTA ATG

CCA AGA TGA C-3P) sản xuất một speci band 235 bp ¢ c cho G. margarita MAFF520054 và CK trong sự kết hợp với M13 mồi mini-vệ tinh (hình. 1a). Bộ mồi này đã không tạo ra ban nhạc từ các chế DNA khác hơn so với các chủng phân lập. Cặp mồi khác được thử nghiệm đã không am- plify như một sản phẩm (dữ liệu không hiển thị). Kết quả là tái sản xuất với các chế phẩm ADN của bào tử di¡erent của mỗi cô lập. Các chuỗi ADN chẩn đoán cho
G. margarita MAFF520054 và CK đã được gửi vào các cơ sở dữ liệu GenBank / EMBL / DDBJ (số nhập AB052750). Trình tự của các sản phẩm chẩn đoán đã được tìm kiếm tương đồng của chương trình FASTA trong cơ sở dữ liệu EMBL / GenBank / DDBJ. Chúng tôi đã chọn một khu vực mà hiếm khi phù hợp với trình tự xuất bản để thiết kế một đầu dò oligonucleotide, 230PBC (5P-CTA ACC ATT TAT CGC ATT TTT CGC AGT AGC GAG TGT ATT GCC AAG-3P). Các thăm dò, 230PBC, hybrid- ized chỉ với các sản phẩm PCR từ cả G. margarita MAFF520054 và CK (Hình. 1b). Không có sản phẩm PCR cực cực phản ứng với các đầu dò được thu thập từ các DNA của các chủng khác được thử nghiệm ngay cả trong các kích cỡ di¡erent. Điều này cũng đúng đối với các loại nấm khác được thử nghiệm (dữ liệu không hiển thị). Chúng tôi đã thử nghiệm e/ciency của giao thức để phát hiện DNA sợi nấm của G. margarita MAFF520054 trong rễ cây. PCR bán lồng nhau phát hiện rõ thực dân AMF trong




hình. 2. Phân lập-cụ thể ¢ phát hiện c G. margarita MAFF520054 trong rễ cây AMF thuộc địa. a: DNA AMF trong các chế phẩm từ rễ cây được phát hiện bằng PCR bán lồng nhau với các bộ mồi của VANS1 và AM1-2 tiếp theo VANS1 và NS21. b: Một phần của mỗi chuẩn bị thể hiện trong bảng điều khiển một đã bị AMPLI ¢ cation với các bộ mồi của M13 mini-vệ tinh và 639R tiếp theo thăm dò với 230PBC. Ngõ 1, PX174 / HaeIII tiêu hóa; ngõ 2, kiểm soát tiêu cực; ngõ 3, G. margarita MAFF520054 sporal DNA; làn 4, 5, rễ hành tây thuộc địa của G. margarita MAFF520054; làn đường 6, 7, hành lá thuộc địa của G. margarita MAFF520054; làn 8, 9, cỏ bahia và rễ cỏ ba lá màu trắng thuộc địa của G. marga- rita sp. Ni-A; tuyến đường 10, 11, cỏ bahia và rễ cỏ ba lá màu trắng thuộc địa của G. margarita MAFF520052; tuyến đường 12, 13, cỏ bahia và rễ cỏ ba lá màu trắng thuộc địa của G. rosea MAFF520062; ngõ 14, PX174 / HaeIII digest.



Hình. 3. Sự phân bố của các locus tương đồng với vệ tinh hậu se- eucaryotic.



Rễ (2a. Hình). Trong số các chế phẩm có chứa DNA nấm, các bộ mồi ampli ¢ ed trình tự chẩn đoán chỉ từ rễ hành tây thuộc địa của G. margarita MAFF520054 (Hình. 2b).
Đây là ¢ đầu tiên nghiên cứu về chủng-cụ thể ¢ c identi ¢ ca- sự G. margarita bằng cách sử dụng một chuỗi DNA duy nhất như là một marker phân tử chẩn đoán. Bằng cách tập trung vào trình tự, chúng ta có thể đối phó với không chỉ các bào tử (Hình. 1) mà còn trồng rễ thuộc địa của AMF quan tâm (Hình. 2). Điều này có thể có một lợi thế lớn trong nghiên cứu sinh thái của AMF trong- troduced vào môi trường so với các phương pháp dựa trên sự đa hình của sản phẩm PCR. Gần đây, cô lập, cụ thể ¢ c identi ¢ cation của Glomus sp. từ rễ cây được thực hiện bằng các phương tiện đa hình thông confor- sợi đơn của sản phẩm PCR từ gion lại D2 của gen rRNA tiểu đơn vị lớn [17]. Như trong trường hợp của ITSS, sự biến đổi trong nội bộ dòng phân lập của chuỗi D2 thấp đến khía cạnh các Speci ¢ thành phố của chuỗi như một marker phân tử cho một Gl. coronatus cô lập [8]. Để truy tìm số phận của
G. margarita CK trong môi trường, ngược lại, detec tion của trình tự chẩn đoán là một phương pháp có thể khá đơn giản và giáo.
Chúng tôi đã kiểm tra mối quan hệ của chuỗi các cao repe