2. Materials and methods2.1. Bacter

2. Materials and methods

2.1. Bacterial strains and culture conditions

Eight Bacillus and 2 Lysinibacillus spp. strains isolated from different
productions of maari (Parkouda et al., 2010) were screened for
their antimicrobial activity against 31 indicator bacteria representing
Gram-positive and Gram-negative bacteria (Table 1). B. subtilis subsp.
spizizenii DSM 15029 and B. subtilis subsp. subtilis DSM 10 (ATCC
6051), encoding subtilin and subtilosin respectively, were used as
positive controls in polymerase chain reaction (PCR) experiments.
All the strains were maintained as stock cultures at −80 °C in
Brain Heart Infusion (BHI) medium (Oxoid, England) with 20% (v/v)
glycerol as cryoprotectant.

2.2. Preparation of inocula of Bacillus and Lysinibacillus spp. isolated
from maari

For all the experiments, inocula of the dominant aerobic sporeformers
isolated from traditional maari (Bacillus spp. and Lysinibacillus
spp.) were prepared as follows: From BHI agar plates incubated for
24 h at 37 °C, the Bacillus and Lysinibacillus strains were subcultured
for 18 h at 37 °C in 10 ml of BHI broth, pH 7. The cultures were centrifuged
at 5000 g for 15 min and the pellet resuspended in 10ml of
sterile saline (8.5 g/l NaCl and 1.5 g/l bactopeptone (Difco, France),
pH 7.0). The number of cells/ml was estimated by microscopy using a
counting chamber (Neubauer, Wertheim, Germany) and dilutions
were made in sterile saline to obtain a rate of inoculation of 105cells/ml.

2.3. Preparation of cell-free supernatant (CFS)

Each strain being investigated for antimicrobial properties was
grown in 50 ml of BHI broth at 37 °C with agitation 120 rpm for 18 h.
The cell-free supernatant (CFS) was obtained by centrifuging
the culture (10,000 g for 30 min at 4 °C). The pH of the supernatant
was adjusted to 7 with 1 N NaOH to exclude the antimicrobial effect
of acid production, followed by filtration of the supernatant through
a 0.45 μm pore-size filter.


2.4. Screening for antimicrobial activity under aerobic, microaerobic and
anaerobic atmospheric conditions

An agar spot method was used to assess the production of antimicrobial
compounds by 10 isolates representing the dominant aerobic
sporeformers during fermentation of baobab seeds into traditional
maari against 31 indicator bacteria. The agar spot test described by
Ouoba et al. (2007) was carried out. A volume of 100 μl cell suspension
of indicator microorganisms cultured for 18 h (about
107 CFU/ml) was mixed in 10 ml BHI agar in a Petri dish and allowed
to solidify. Approximately 105 CFU/ml of the Bacillus spp. was spotted
on the surface of BHI agar and the dish incubated at 37 °C for 24 h.
The test was performed under aerobic, microaerobic (6% O2, 12% CO2)
(Campygen, Oxoid) and anaerobic (b1% oxygen, 9–13% CO2) (Anaerogen,
Oxoid) atmospheric conditions. BHI broth was tested as a negative
control on each plate. The presence of a clear zone around the spot indicating
inhibition was measured and the results reported in mm. The
experiment was performed in duplicate on three separate occasions.
The agar-well diffusion method described by Motta and Brandelli
(2002) was used to investigate the antimicrobial effect of CFS from
of the aerobic sporeformers.
For testing, 10ml BHI agar inoculated with approximately 106 CFU/
ml of indicator microorganism was mixed into a Petri dish and left to
solidify. Wells were cut with a sterile cork borer (diameter: 6 mm) in
the agar and 50 μl of CFS was added. The plates were incubated at
37 °C. The presence of a clear zone around the spot (24 h incubation)
indicating inhibition wasmeasured using a slide caliper and the results
reported in millimeter. The experiment was performed in duplicate on
three separate occasions.


2.5. Sensitivity of antimicrobial substance to catalase, proteolytic
enzymes, heat and pH

The CFS from the cultures of B3, B122 and B222 was characterized
with respect to thermal stability, pH sensitivity, sensitivity to catalase,
and susceptibility to degradation by enzymes according to the method
described by Cladera-Olivera et al. (2004). Bacillus cereus NVH391–98
was used as indicator organism in these and all subsequent experiments.
The sensitivity after each treatment was determined using
the agar-well diffusion method. In all assays, neutralized, untreated
filtrates served as controls. Each assay was performed in duplicate.
Sensitivity to enzymes (all obtained from Sigma-Aldrich) was
tested by treating CFS at 37 °C for 2 h with catalase (Product number
C1345, bovine liver), papain from papaya latex (P2322), protease
from Streptomyces griseus (P2325), proteinase K from Tritirachium
album (P2548), and trypsin from bovine pancreas (P2328), each at a
final concentration of 1 mg ml-1. The activity remaining after enzyme
digestion was determined by the agar-well diffusion method.
To determine the thermal stability, aliquots of each (CFS) were
heated at 40 °C, 60 °C, 80 °C or 100 °C for 30 min, or autoclaved
(121 °C) for 15 min; the aliquots of each (CFS) were also exposed to
4 °C for 2 weeks. The antimicrobial activity was then tested by the
agar-well diffusion method.
For the determination of pH sensitivity the CFS was adjusted to pH
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 with HCl or NaOH, incubated for 4 h at
37 °C and the activity remaining was determined by the agar-well diffusion
method. BHI adjusted to pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 served as control.

Kết quả (Việt) 1:

2. tài liệu và phương pháp2.1. vi khuẩn chủng và điều kiện văn hóaTám Bacillus và 2 Lysinibacillus spp. chủng phân lập từ khác nhauCác sản phẩm của maari (Parkouda và ctv., 2010) đã được chiếu chohoạt động kháng khuẩn của họ chống lại vi khuẩn chỉ số 31 đại diện choVi khuẩn Gram dương và vi khuẩn (bảng 1). B. subtilis phân loàispizizenii DSM 15029 và B. subtilis subsp. subtilis DSM 10 (ATCC6051), mã hóa subtilin và subtilosin tương ứng, được sử dụng nhưtích cực điều khiển trong polymerase phản ứng dây chuyền (PCR) thí nghiệm.Tất cả các chủng được duy trì như nền văn hóa cổ ở −80 ° C trongNão trái tim truyền (BHI) trung bình (Oxoid, Vương Quốc Anh) với 20% (v/v)Nhóm glycerol như cryoprotectant.2.2. chuẩn bị của inocula Bacillus và Lysinibacillus spp. bị cô lậptừ maariCho tất cả các thí nghiệm, inocula của hiếu khí sporeformers chi phốibị cô lập từ truyền thống maari (Bacillus spp. và Lysinibacillusspp.) đã được chuẩn bị như sau: từ BHI agar tấm ủ cho24 h 37 ° C, giống trực khuẩn và Lysinibacillus được subculturedcho 18 h 37 ° C trong 10 ml của BHI canh, pH 7. Các nền văn hóa đã ly5000 g cho 15 phút và miếng resuspended trong 10mlvô trùng saline (8.5 g/l NaCl và 1.5 g/l bactopeptone (Difco, Pháp),pH 7.0). Số lượng tế bào/ml được ước tính bằng cách sử dụng kính hiển vi mộtđếm buồng (Neubauer, Wertheim, Đức) và dilutionsđã được thực hiện trong dung dịch muối vô trùng để có được một tỷ lệ tiêm phòng của 105cells/ml.2.3. chuẩn bị tế bào miễn phí supernatant (CFS)Mỗi căng thẳng đang được điều tra cho tính chất kháng khuẩnphát triển trong 50 ml của BHI canh ở 37 ° C với kích động 120 rpm cho 18 h. Miễn phí di động supernatant (CFS) thu được bằng centrifugingvăn hóa (10.000 g trong 30 phút tại 4 ° C). Độ pH của supernatantđược điều chỉnh để 7 với 1 N NaOH để loại trừ các tác dụng kháng khuẩnsản xuất axit, theo sau là lọc của supernatant thông quamột bộ lọc kích thước lỗ 0.45 μm.2.4. kiểm tra cho các hoạt động kháng khuẩn dưới hiếu khí, microaerobic vàđiều kiện khí quyển kỵ khíMột phương pháp tại chỗ agar đã được sử dụng để đánh giá sản xuất kháng khuẩnCác hợp chất 10 cô lập đại diện cho chủ đạo hiếu khísporeformers trong quá trình lên men bao báp hạt vào truyền thốngmaari chống lại 31 chỉ số vi khuẩn. Kiểm tra tại chỗ agar được mô tả bởiOuoba et al. (2007) được thực hiện. Một khối lượng 100 μl di động đình chỉchỉ số vi sinh vật nuôi cấy cho 18 h (về107 CFU/ml) được trộn lẫn trong 10 ml BHI agar trong một món ăn Petri và cho phépđể củng cố. CFU/ml khoảng 105 Bacillus spp. đã được phát hiệntrên bề mặt của BHI agar và các món ăn ủ tại 37 ° C cho 24 h.Các thử nghiệm được thực hiện dưới hiếu khí, microaerobic (6% O2, 12% CO2)(Campygen, Oxoid) và kỵ khí (b1% ôxy, 9 – 13% CO2) (Anaerogen,Điều kiện khí quyển Oxoid). BHI canh đã được thử nghiệm như là một tiêu cựckiểm soát trên mỗi tấm. Sự hiện diện của một khu vực rõ ràng xung quanh cho thấy tại chỗức chế được đo và kết quả báo cáo trong mm. cácthử nghiệm đã được thực hiện trong bản sao ba lần riêng biệt.Phương pháp phổ biến agar-cũng được mô tả bởi Motta và Brandelli(2002) đã được sử dụng để điều tra tác dụng kháng khuẩn của CFS từcủa sporeformers hiếu khí.Để thử nghiệm, 10ml BHI agar tiêm chủng với khoảng 106 CFU /ml của vi sinh vật chỉ số được pha trộn thành một món ăn Petri và để lại chocủng cố. Wells đã giảm với một vô trùng cork borer (đường kính: 6 mm) trongagar và 50 μl CFS đã được bổ sung. Các mảng được ủ tại37 ° C. Sự hiện diện của một khu vực rõ ràng xung quanh thành phố tại chỗ (24 h ấp)chỉ ra sự ức chế wasmeasured bằng cách sử dụng một thước đo trượt và kết quảbáo cáo trong mm. Các thử nghiệm được thực hiện trong bản sao trênba lần khác nhau.2.5. sự nhạy cảm của kháng sinh chất để catalase, proteolyticenzyme, hơi nóng và độ pHCFS từ các nền văn hóa của B3, B122 và B222 được đặc trưngĐối với sự ổn định nhiệt, độ pH nhạy cảm, nhạy cảm với catalase,và tính nhạy cảm với sự thoái hóa bởi enzym theo phương phápMô tả bởi Cladera-Olivera et al. (năm 2004). Bacillus cereus NVH391-98được sử dụng chỉ số sinh vật ở đây và tất cả các thí nghiệm tiếp theo.Sự nhạy cảm sau khi mỗi lần điều trị đã được xác định bằng cách sử dụngphương pháp agar-cũng phổ biến. Trong thử nghiệm tất cả, vô hiệu hóa, được điều trịfiltrates phục vụ như điều khiển. Mỗi khảo nghiệm được thực hiện vào bản sao.Nhạy cảm với enzyme (Tất cả thu được từ Sigma-Aldrich) làthử nghiệm của điều trị CFS lúc 37 ° C cho 2 h với catalase (sản phẩm sốC1345, bò gan), papain từ đu đủ cao su (P2322), proteasetừ Streptomyces griseus (P2325), proteinase K từ Tritirachiumalbum (P2548), và trypsin từ tuyến tụy bò (P2328), mỗi lúc mộtcuối cùng tập trung của 1 mg ml-1. Các hoạt động còn lại sau khi enzymtiêu hóa đã được xác định bằng phương pháp agar-cũng phổ biến.Để xác định sự ổn định nhiệt, đã aliquots của mỗi (CFS)nước nóng ở 40 ° C, 60 ° C, 80 ° C hoặc 100 ° C trong 30 phút, hoặc autoclaved(121 ° C) cho 15 phút; aliquots mỗi (CFS) cũng được tiếp xúc với4 ° C trong 2 tuần. Kháng khuẩn hoạt động sau đó đã được thử nghiệm bởi cácphương pháp Agar-cũng phổ biến.Xác định độ pH nhạy cảm CFS được điều chỉnh để pH3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 với HCl hoặc NaOH, ủ cho 4 h37 ° C và số còn lại hoạt động đã được xác định bởi sự khuếch tán agar-Vângphương pháp. BHI điều chỉnh để pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 phục vụ như là điều khiển.

Kết quả (Việt) 2:

2. Vật liệu và phương pháp 2.1. Các chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy Tám Bacillus và 2 Lysinibacillus spp. các chủng phân lập từ khác nhau sản phẩm của maari (Parkouda et al., 2010) đã được sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của họ chống lại 31 loại vi khuẩn chỉ số đại diện cho các vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Bảng 1). B. subtilis subsp. spizizenii DSM 15.029 và B. subtilis subsp. subtilis DSM 10 (ATCC 6051), subtilin mã hóa và subtilosin tương ứng, đã được sử dụng như điều khiển tích cực trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thí nghiệm. Tất cả các chủng này được duy trì như một nền văn hóa cổ ở -80 ° C trong Brain tim Infusion (BHI) trung bình ( Oxoid, Anh) với 20% (v / v) glycerol là chất bảo vệ lạnh. 2.2. Chuẩn bị inocula của Bacillus và Lysinibacillus spp. cô lập từ maari Đối với tất cả các thí nghiệm, inocula của sporeformers aerobic chi phối phân lập từ truyền thống maari (. Bacillus spp và Lysinibacillus . spp) đã được chuẩn bị như sau: Từ tấm thạch BHI ủ trong 24 giờ ở 37 ° C, Bacillus và chủng Lysinibacillus được cấy trong 18 giờ ở 37 ° C trong 10 ml nước dùng BHI, pH 7. Các nền văn hóa được ly tâm ở 5000 g trong 15 phút và pellet lơ lửng trong 10ml dung dịch muối vô trùng (8,5 g / l NaCl và 1,5 g / l bactopeptone (Difco, Pháp), pH 7,0). Số lượng tế bào / ml được ước tính bằng cách sử dụng một kính hiển vi buồng đếm (Neubauer, Wertheim, Đức) và pha loãng đã được thực hiện trong dung dịch muối vô trùng để có được một tỷ lệ tiêm chủng của 105cells / ml. 2.3. Chuẩn bị bề cell-free (CFS) Mỗi dòng được nghiên cứu về kháng sinh đã được phát triển trong 50 ml nước dùng BHI ở 37 ° C với vận động 120 rpm trong 18 h. Các tế bào miễn dịch nổi (CFS) đã thu được bằng cách ly tâm văn hóa (10.000 g trong 30 phút ở 4 ° C). Độ pH của các nổi đã được điều chỉnh 7 với 1 N NaOH để loại trừ các tác dụng kháng khuẩn của sản xuất acid, quá trình lọc của các nổi thông qua một bộ lọc 0,45 mm lỗ chân lông, kích thước. 2.4. Khám sàng lọc kháng vi sinh vật dưới aerobic, microaerobic và điều kiện khí quyển kỵ khí Một phương pháp tại chỗ thạch đã được sử dụng để đánh giá việc sản xuất kháng sinh hợp chất của 10 mẫu phân lập đại diện cho aerobic trội sporeformers quá trình lên men hạt baobab vào truyền thống maari chống lại 31 loại vi khuẩn chỉ thị. Các bài kiểm tra tại chỗ thạch được mô tả bởi Ouoba et al. (2007) đã được thực hiện. Một khối lượng 100 ml dịch treo tế bào của vi sinh vật chỉ nuôi cho 18 h (khoảng 107 CFU / ml) được trộn lẫn trong thạch BHI 10 ml trong một đĩa Petri và cho phép củng cố. Khoảng 105 CFU / ml của Bacillus spp. đã được phát hiện trên bề mặt của BHI agar và các món ăn ủ ở 37 ° C trong 24 h. Xét nghiệm này được thực hiện dưới aerobic, microaerobic (6% O2, 12% CO2) (Campygen, Oxoid) và yếm khí (b1% oxy, 9 -13% CO2) (Anaerogen, Oxoid) điều kiện khí quyển. BHI thịt được kiểm tra như một tiêu cực kiểm soát trên mỗi tấm. Sự hiện diện của một khu vực rõ ràng xung quanh chỉ chỗ ức chế được đo và kết quả báo cáo trong mm. Các thí nghiệm được thực hiện tại trùng lặp trong ba trường hợp riêng biệt. Các phương pháp khuếch tán agar-cũng được mô tả bởi Motta và Brandelli (2002) đã được sử dụng để nghiên cứu tác động kháng khuẩn của CFS từ của sporeformers aerobic. Để thử nghiệm, thạch BHI 10ml chủng với khoảng 106 CFU / ml chỉ số vi sinh vật đã được trộn vào đĩa Petri và còn lại để củng cố. Wells đã được cắt bằng một nút chai vô trùng sâu đục (đường kính: 6 mm) trong môi trường thạch và 50 ml CFS đã được bổ sung. Các tấm được ủ ở 37 ° C. Sự hiện diện của một khu vực rõ ràng xung quanh (h ủ 24) tại chỗ cho thấy sự ức chế wasmeasured sử dụng một caliper trượt và kết quả báo cáo trong milimet. Thí nghiệm được thực hiện tại trùng lặp trên ba trường hợp riêng biệt. 2.5. Độ nhạy của chất kháng khuẩn để catalase, proteolytic enzymes, nhiệt và pH CFS từ các nền văn hóa của B3, B122 và B222 được đặc trưng đối với sự ổn định nhiệt, độ nhạy pH, độ nhạy cảm với catalase, với sự nhạy cảm và suy thoái bởi các enzyme theo phương pháp mô tả bởi Cladera-Olivera et al. (2004). Bacillus cereus NVH391-98 đã được sử dụng như là chỉ số sinh vật trong những điều này và tất cả các thí nghiệm tiếp theo. Độ nhạy sau mỗi lần điều trị đã được xác định bằng phương pháp khuếch tán agar-tốt. Trong tất cả các xét nghiệm, trung hòa, không được điều trị các bộ lọc phục vụ như kiểm soát. Mỗi khảo nghiệm đã được thực hiện thành hai bản. Nhạy cảm với các enzym (tất cả thu được từ Sigma-Aldrich) đã được thử nghiệm bởi CFS điều trị ở 37 ° C trong 2 giờ với catalase (số sản phẩm C1345, gan bò), papain từ đu đủ latex (P2322), protease từ Streptomyces griseus (P2325), proteinase K từ Tritirachium album (P2548), và trypsin từ tuyến tụy của bò (P2328), mỗi lúc một nồng độ cuối cùng của 1 mg ml-1. Các hoạt động còn lại sau khi enzyme tiêu hóa được xác định bằng phương pháp khuếch tán agar-tốt. Để xác định sự ổn định nhiệt, phân ước của mỗi (CFS) được đun nóng ở 40 ° C, 60 ° C, 80 ° C hoặc 100 ° C trong 30 phút, hoặc hấp (121 ° C) trong 15 phút; các phần phân ước của mỗi (CFS) cũng đã được tiếp xúc với nhiệt độ 4 ° C trong 2 tuần. Các hoạt động kháng khuẩn sau đó được kiểm tra bằng các phương pháp khuếch tán agar-tốt. Đối với việc xác định độ nhạy pH CFS đã được điều chỉnh để pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 với HCl hoặc NaOH, ủ 4 giờ ở 37 ° C và các hoạt động còn lại được xác định bằng sự khuếch tán agar-tốt phương pháp. BHI điều chỉnh pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 phục vụ như kiểm soát.