toi yeu ban dichReferencesExpressio

toi yeu ban dich
References
Expression of Biologically Active Recombinant B-
Domain-Deleted Human Factor VIII in Mammalian Cells
N. Amirizahdeh,1 A. Zomorodipour,2,* A. Deezagi,3 3A.A. Pourfathollah,1 M. 6
Khodabandeh,4 G. Rastegar Lari,5 H. Lenjannejadian, F. Ataie,2 and M. Salek
Hemophilia A is an X-linked recessive bleeding disorder, widely prevalent throughout the
world, for which, replacement therapy is a current treatment done by infusion of either human plasma derived FVIII or recombinant FVIII. In order to produce a recombinant form of biologically active human coagulation factor VIII, a mammalian expression system is necessary for proper post-translational modifications. In this regard, two types of mammalian cell lines, COS7 and CHO, were transfected with a recombinant plasmid, constructed by insertion of a NotI restriction fragment containing B-domain-deleted cDNA of hFVIII in pcDNA3 plasmid, downstream of CMV promoter. By performing one-stage clotting assay as well as ELISA test on the conditioned media collected from transfected cells, we confirmed transient and stable expression of rhFVIII in the transfected COS7 and CHO cells, respectively. The presence of rhFVIII mRNA was also demonstrated by performing RT-PCR on total cellular RNA, extracted from the stably transfected CHO cells. The highest amount of produced active rhFVIII in the stably transfected CHO cells was estimated to be around 0.1 U/ml of the cultured media. By applying southern blotting experiment on the digested as well as high molecular weight chromosomal DNA, prepared from the stably transfected CHO cells, we have demonstrated the presence of the rhFVIII expressing plasmid in the CHO cells. The recombinant plasmid as well as the stable FVIII expressing cell line developed in this study has provided useful bases for further molecular studies of various important factors influencing the expression efficiency of rhFVIII.Media, Enzymes, Chemicals and Kits
Luria-Bertani (LB) [10 g/1 Bacto-tryptone, 5 g/1
Bacto yeast extract, and 10 g/1 NaCl, pH 7.0 with NaOH, purchased from Merk-Germany] was used as the bacterial culture medium, and ampicillin (100 mg/ml) was added when required to maintain selection pressure. Enzymes NotI, BglII, Taq DNA polymerase and T4 DNA ligase were purchased from the Roche-Germany. AMV-reverse transcriptase was purchased from (Fermentas). Geneticin (G-418) and the transfection reagent, FuGENE6, were obtained from Roche- Germany. Alkaline lysis method was applied for plasmid DNA preparations [16]. The commercially prepared columns (Roche-Germany) were used for the purification of DNA. The COS7 cells were grown in Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) (Gibco-BRL Llife Technology), 100 U/ml
penicillin G and 100g/ml streptomycin (Sigma-
Germany). The CHO cells were grown in Hams-F12 (Gibco-BRL Llife Technology). ELISA kit for measuring hFVIII antigen (Asserachrom VIIIc: Ag) and deficient FVIII plasma were purchased from Diagnostica Stago-France. Citrated normal pooled- plasma (kindly provided by Kamran Atarodi in the quality control unit of iranian blood transfusion organization) was used as a standard in coagulation test. Dig- DNA- labeling and Dig-nucleic acid detection kits and the positive charged membrane (Roche-Germany) were used in southern blotting experiment. RNXTM (plus) RNA isolation kit (Cinnagen-Iran) was used for isolation of the total cellular RNA.


Construction of the Recombinant pcDNA3-FVIII
Plasmid
DNA manipulation techniques, such as plasmid DNA

Kết quả (Việt) 1:

toi yeu ban dichTài liệu tham khảoBiểu hiện của hoạt tính sinh học tái tổ hợp B- Đã xóa tên miền con người yếu tố VIII trong tế bào động vật có vú N. Amirizahdeh, 1 A. Zomorodipour, 2, * A. Deezagi, 3 3A.A. Pourfathollah, 1 M. 6 Khodabandeh, 4 G. Rastegar Lari, 5 H. Lenjannejadian, F. Ataie, 2 và M. Salek Dể băng huyết A là một liên kết với X lặn chảy máu rối loạn, phổ biến rộng rãi trên khắp các thế giới, mà, liệu pháp thay thế là một điều trị hiện tại được thực hiện bởi truyền hoặc huyết tương của con người có nguồn gốc FVIII hoặc tái tổ hợp FVIII. Để tạo ra một hình thức tái tổ hợp của hoạt tính sinh học đông máu của con người yếu tố VIII, một hệ thống động vật có vú biểu hiện là cần thiết để sửa đổi post-translational thích hợp. Về vấn đề này, hai loại tế bào động vật có vú dòng, COS7, CHO, đã được transfected với một plasmid tái tổ hợp, xây dựng bằng cách chèn một đoạn hạn chế NotI có chứa B-tên miền-xóa cDNA của hFVIII trong pcDNA3 plasmid, hạ lưu của CMV promoter. Bằng cách thực hiện một giai đoạn khảo nghiệm đông máu cũng như ELISA kiểm tra trên các phương tiện truyền thông có điều kiện thu thập từ các tế bào transfected, chúng tôi xác nhận biểu hiện thoáng qua và ổn định của rhFVIII trong các transfected COS7 và CHO tế bào, tương ứng. Sự hiện diện của rhFVIII mRNA cũng đã được chứng minh bằng cách thực hiện RT-PCR trên tất cả di động RNA, chiết xuất từ các tế bào CHO ổn định transfected. Số sản xuất rhFVIII hoạt động trong các tế bào CHO ổn định transfected, cao nhất được ước tính khoảng cách 0.1 U/ml của các phương tiện truyền thông văn hóa. Bằng cách áp dụng thử nghiệm thấm phía nam trên DNA nhiễm sắc thể tiêu hóa cũng như cao trọng lượng phân tử, chuẩn bị từ các tế bào CHO ổn định transfected, chúng tôi đã chứng minh sự hiện diện của rhFVIII thể hiện plasmid trong các tế bào CHO. Plasmid tái tổ hợp cũng như ổn định FVIII thể hiện dòng tế bào phát triển trong nghiên cứu này đã cung cấp cơ sở hữu ích cho biết thêm các nghiên cứu phân tử của yếu tố quan trọng khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện của rhFVIII.Media, enzyme, hóa chất và bộ dụng cụ Luria-Bertani (LB) [10 g/1 Bacto-tryptone, 5 g/1 Bacto nấm men chiết xuất, và 10 g/1 NaCl, pH 7.0 với NaOH, mua từ Merk-Đức] đã được sử dụng như phương tiện văn hóa vi khuẩn, và ampicillin (100 mg/ml) đã được bổ sung khi cần thiết để duy trì áp lực lựa chọn. Enzym NotI, BglII, Taq DNA polymerase và T4 DNA ligase đã được mua từ Roche-Đức. AMV-ngược đã được mua từ (Fermentas). Geneticin (G-418) và tinh khiết transfection, FuGENE6, đã thu được từ Roche - Đức. Kiềm lysis phương pháp được áp dụng cho plasmid DNA chuẩn bị [16]. Chuẩn bị sẵn sàng thương mại cột (Roche-Đức) đã được sử dụng cho việc thanh lọc của DNA. Các tế bào COS7 được trồng ở Eagle của Dulbeco lần trung bình (DMEM) bổ sung với 10% nhiệt gan thai nhi bò huyết thanh (FBS) (Gibco-BRL Llife công nghệ), 100 U/ml penicillin G và 100g/ml streptomycin (Sigma- Đức). Các tế bào CHO được trồng ở dăm bông-F12 (Gibco-BRL Llife công nghệ). ELISA bộ đo hFVIII kháng nguyên (Asserachrom VIIIc: Ag) và thiếu FVIII plasma đã được mua từ Diagnostica Stago-Pháp. Citrated bình thường gộp lại-plasma (vui lòng cung cấp bởi Kamran Atarodi tại các đơn vị kiểm soát chất lượng của tổ chức Iran truyền máu) đã được sử dụng như là một tiêu chuẩn trong thử nghiệm đông máu. Đào - DNA - ghi nhãn và đào nucleic acid phát hiện bộ dụng cụ và các màng tế bào điện tích cực (Roche-Đức) đã được sử dụng trong thử nghiệm thấm phía Nam. RNXTM (plus) RNA cô lập kit (Cinnagen-Iran) được sử dụng để cô lập RNA di động tất cả. Xây dựng pcDNA3 tái tổ hợp-FVIII Plasmid DNA thao tác kỹ thuật, chẳng hạn như plasmid DNA

Kết quả (Việt) 2:

toi ban yeu dich
Tài liệu tham khảo
Biểu hiện của tính sinh học mới tái tổ hợp B-
Domain-Deleted Human Factor VIII trong tế bào động vật có vú
N. Amirizahdeh, 1 A. Zomorodipour, 2, * A. Deezagi, 3 3A.A. Pourfathollah, 1 M. 6
Khodabandeh, 4 G. Rastegar Lari, 5 H. Lenjannejadian, F. Ataie, 2 và M. Salek
Hemophilia A là một rối loạn X-linked recessive chảy máu, phổ biến rộng rãi trên toàn
thế giới, mà, liệu pháp thay thế là một điều trị hiện nay thực hiện bằng cách tiêm truyền của một trong hai con người từ huyết tương FVIII hoặc FVIII tái tổ hợp. Để sản xuất một hình thức tái tổ hợp của các hoạt chất sinh học yếu tố đông máu VIII của con người, một hệ thống biểu hiện động vật có vú là cần thiết cho thích hợp thay đổi hậu dịch. Về vấn đề này, hai loại dòng tế bào động vật có vú, và COS7 CHO, được transfected với plasmid tái tổ hợp, xây dựng bằng cách chèn một Noti hạn chế mảnh chứa B-miền-xóa cDNA của hFVIII trong pcDNA3 plasmid, hạ lưu của CMV promoter. Bằng cách thực hiện một giai đoạn khảo nghiệm đông máu cũng như ELISA xét nghiệm trên phương tiện truyền thông có điều kiện thu thập được từ các tế bào transfected, chúng tôi khẳng định biểu hiện thoáng qua và ổn định của rhFVIII trong các tế bào COS7 và CHO transfected, tương ứng. Sự hiện diện của rhFVIII mRNA cũng đã được chứng minh bằng cách thực hiện RT-PCR trên tổng số RNA tế bào, được chiết xuất từ các tế bào CHO ổn định transfected. Số tiền cao nhất của sản xuất đang hoạt động rhFVIII trong các tế bào CHO ổn định transfected được ước tính là khoảng 0,1 U / ml của các phương tiện truyền thông có văn hóa. Bằng cách áp dụng thí nghiệm thấm phía nam trên tiêu hóa cũng như phân tử DNA trọng lượng nhiễm sắc thể cao, được chế biến từ các tế bào CHO ổn định transfected, chúng tôi đã chứng minh sự hiện diện của các thể hiện plasmid rhFVIII trong các tế bào CHO. Các plasmid tái tổ hợp cũng như các dòng tế bào FVIII ổn định thể hiện sự phát triển trong nghiên cứu này đã cung cấp cơ sở hữu ích cho các nghiên cứu phân tử hơn nữa của các yếu tố quan trọng khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện của rhFVIII.Media, Enzym, Hóa chất và Kít
Luria-BERTANI (LB) [10 g / 1 Bacto-tryptone, 5 g / 1
Bacto chiết nấm men, và 10 g / 1 NaCl, pH 7.0 với NaOH, mua từ Merk-Đức] đã được sử dụng làm môi trường vi khuẩn nền văn hóa, và ampicillin (100 mg / ml) được thêm vào khi cần thiết để duy trì áp lực chọn lọc. Enzymes Noti, BglII, polymerase Taq DNA và T4 DNA ligase được mua từ Roche-Đức. Transcriptase AMV-ngược được mua từ (Fermentas). Geneticin (G-418) và các thuốc thử thâm chuyển, FuGENE6, đã thu được từ Roche- Đức. Phương pháp ly giải Alkaline được áp dụng đối với các chế DNA plasmid [16]. Các cột thương mại chuẩn bị (Roche-Đức) đã được sử dụng để tinh chế DNA. Các tế bào COS7 được trồng trong các sửa đổi vừa Eagle của Dulbeco của (DMEM) bổ sung với 10% nhiệt bất hoạt huyết thanh bào thai bò (FBS) (Gibco BRL-Llife Technology), 100 U / ml
penicillin G và 100g / ml streptomycin (Sigma-
Đức). Các tế bào CHO được trồng trong Hams-F12 (Gibco BRL-Llife Công nghệ). ELISA kit đo hFVIII kháng nguyên (Asserachrom VIIIc: Ag) và thiếu plasma FVIII được mua từ Diagnostica STAGO-France. Citrated plasma pooled- bình thường (vui lòng cung cấp bởi Kamran Atarodi trong các đơn vị kiểm soát chất lượng của iranian tổ chức truyền máu) được sử dụng như là một tiêu chuẩn trong thử nghiệm đông máu. Ghi nhãn DNA- Dig- và bộ dụng cụ phát hiện axit Dig-nucleic và màng tích điện dương (Roche-Đức) đã được sử dụng trong thí nghiệm thấm phía Nam. RNXTM (plus) RNA ly kit (Cinnagen-Iran) đã được sử dụng để phân lập các tổng RNA của tế bào. Xây dựng của tái tổ hợp pcDNA3-FVIII Plasmid kỹ thuật thao tác DNA, chẳng hạn như DNA plasmid