Materials and Methods2.1. Plant mat

Materials and Methods
2.1. Plant materials and crossing scheme
The scheme for constructing the plant
materials used in this study is summarized in
Figure 1. A highly salt tolerant FL478 (IR
66946-3R-178-1-1) was used as the donor of
Saltol QTLs, whereas Bac Thom 7 (O. sativa
spp. indica), a popular growing Vietnamese
elite cultivar with high quality was used as the
recipient parent. A total 477 SSR markers
distributed in the 12 chromosomes including
foreground, recombinant and background
markers were screened. For the MABC scheme,
Bac Thom 7 was crossed with FL478 to obtain
F1 seeds (Fig. 1). F1s were backcrossed with
Bac Thom 7 to obtain a large number of BC1F1
seeds. In the BC1F1 generation, individual plants
that were heterozygous at the Saltol locus were
identified reducing the population size for
further screening (foreground selection). From
the individual plants that were heterozygous for
Saltol, those that were homozygous for the
recipient allele at one marker locus (RM10825)
distally franking the Saltol locus (i.e.
recombinant) were identified. We termed this as
“recombinant selection” [17]. Some used
markers in detail are shown in Table 1. From
these recombinant plants, individuals with the
fewest number of markers from the donor
genome were selected (background selection).
In the second and third BC generations, the
same strategy was followed for selection of
individual plants with the desired allele
combination at the target loci including
selection for recombinants between Saltol and
the nearest proximal marker locus (RM10694)
and suitable genomic composition at the nontarget
loci and crossed with the recipient parent
to develop the next generation. The selected
BC2 and BC3 plants were self-pollinated for
further analyses.
2.2. Molecular marker analysis
DNA was extracted from juvenile leaves of
2-week-old plants using a modified protocol as
described by Zheng et al. (1995) [18]. PCR was
performed in 10 µl reactions containing 5–25
ng of DNA template, 1 µl 10 X TB buffer
(containing 200 mM Tris–HCl pH 8.3, 500 mM
KCl, 15 mM MgCl2), 1 µl of 1 mM dNTP, 0.50
µl each of 5 µM forward and reverse primers
and 0.25 µl of Taq DNA polymerase (4 U/ µl)
using an MJ
Research single or dual 96-well thermal
cycler. After initial denaturation for 5 min at
94°C, each cycle comprised 1 min denaturation
at 94°C, 1 min annealing at 55°C, and 2 min
extension at 72°C with a final extension for 5
min at 72°C at the end of 35 cycles. The PCR
products were mixed with bromophenol blue
gel loading dye and were analyzed by
electrophoresis on 8% polyacrylamide gel using
mini vertical polyacrylamide gels for high
throughput manual genotyping (CBS Scientific
Co. Inc., CA, USA). The gels were stained in
0.5 mg/ml ethidium bromide and were
documented using Alpha Imager 1220 (Alpha
Innotech, CA, USA). Microsatellite or Simple
sequence repeat (SSR) markers were used for
selection [19]. 90 L.H. Linh et al. / VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 28 (2012) 87-99
Figure 1. The scheme of applying MABC to improve salt tolerance in Bac Thom 7 cultivar.
Table 1. Details of markers for foreground and recombinant selection L.H. Linh et al. / VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 28 (2012) 87-99 91
2.3. Foreground and recombinant selection
At the initial stages of the experiment, for
selection of the Saltol locus (foreground), the
reported rice microsatellite (RM) markers
RM493 and RM3412b, which were found to be
tightly linked to Saltol was used for foreground
selection. For franking markers used for
recombinant selection, about 5 Mb region of the
Saltol region was targeted. Four polymophic
microsatellite markers (RM1287, RM10694,
RM562, RM7075) were identified for
recombinant selection (Table 1, Fig. 2).
2.4. Background selection
Microsatellite markers unlinked to Saltol
covering all the chromosomes including the
Saltol carrier chromosome 1, that were
polymorphic between the two parents, were
used for background selection to recover the
recipient genome (Fig. 3). Based on the
polymorphic information, initially evenly
spaced microsatellite markers were selected per
chromosome. At least four polymorphic
microsatellite markers per chromosome were
used. The microsatellite markers that revealed
fixed (homozygous) alleles at nontarget loci at
one generation were not screened at the next
BC generation. Only those markers that were
not fixed for the recurrent parent allele were
analyzed in the following generations. For the
selected plants from BC2F1 and BC3F1, an
additional 84 microsatellite markers were used
to check the fixation of the recipient genome.
2.5. Screening for agronomic traits
The BC3F1 plants with the parents, Bac
Thom 7 and FL478 were grown in a field at the
Thanh Tri, Hanoi, Vietnam. The plants were
laid in a 20 x 15 cm distance and evaluated for
12 traits: 1) Days to heading (dth) were
evaluated as the number of days from sowing
until the panicle headed; 2) Plant height (ph)
was measured in centimeters from the soil
surface to the tip of the tallest panicle (awns
excluded); 3) Panicle length (pl) was measured
in centimeters from the neck to the panicle tip;
4) Panicle number (pn) was calculated as the
number of panicles per plant; 5) 1,000 seed
weight (tsw) was measured in grams as the
weight of 1,000 fully filled seeds per plant; 6)
Primary branch number (pb) was estimated as
the number of primary branches per panicle; 7)
Secondary branch number (sb) was estimated as
the number of secondary branch per panicle; 8)
Seed per panicle (sp) was calculated as the
number of fully filled seed per panicle; 9)
Spikelets per panicle (spp) were calculated as
the number of spikelets per panicle.
2.6. Statistical analyses
The molecular weights of the different
alleles were calculated by Alpha Ease Fc 5.0
software. The marker data was analyzed using
the software Graphical Genotyper [20]. The
homozygous recipient allele, homozygous
dominant allele and heterozygous allele were
scored as ‘A’, ‘B’ and ‘H’, respectively. The
percent markers homozygous for recipient
parent (%A) and the percent recipient alleles
including heterozygous plants (%R) were
calculated. All experimental analyses of the
agronomic traits were performed in a
completely randomized design with at least
thrice. Data were analyzed with the use of the
Duncan’s multiple-range test (P

Kết quả (Việt) 1:

Vật liệu và phương pháp2.1. nhà máy vật liệu và qua chương trìnhCác đề án để xây dựng các nhà máyvật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này tóm tắt trongHình 1. Một khoan dung FL478 (IR cao muối66946-3R-178-1-1) đã được sử dụng như là các nhà tài trợ củaSaltol QTLs, trong khi Bắc Thom 7 (O. sativaspp. indica), người Việt Nam ngày càng tăng phổ biếnưu tú giống với chất lượng cao được sử dụng như cáccha mẹ người nhận. Một dấu hiệu SSR tất cả 477phân phối trong các nhiễm sắc thể 12 bao gồmtiền cảnh, tái tổ hợp và nềnđánh dấu đã được kiểm tra. Cho các đề án MABC,Bắc Thom 7 đã vượt qua với FL478 để có đượcF1 hạt (hình 1). F1 đã được backcrossed vớiBắc Thom 7 để có được một số lớn các BC1F1hạt giống. Trong thế hệ BC1F1, nhà máy cá nhânđó là hổ tại Saltol locusxác định giảm cỡ dân cho tin nhắnhơn nữa, xét nghiệm sàng lọc (tiền cảnh lựa chọn). TừCác nhà máy cá nhân đã được hổ choSaltol, những người đã được màu cho cácngười nhận allele lúc đánh dấu một locus (RM10825)distally franking Saltol locus (tức làtái tổ hợp) đã được xác định. Chúng tôi gọi đây là"tái tổ hợp lựa chọn" [17]. Một số sử dụngđánh dấu trong chi tiết được hiển thị trong bảng 1. Từnhững tái tổ hợp nhà máy, các cá nhân với cácsố fewest của các dấu hiệu từ các nhà tài trợbộ gen đã được lựa chọn (lựa chọn nền tảng).Trong các thế hệ BC thứ hai và thứ ba, cáccùng một chiến lược đã được theo sau cho lựa chọn củaCác nhà máy cá nhân với allele mong muốnsự kết hợp tại loci mục tiêu bao gồmCác lựa chọn cho recombinants giữa Saltol vàgần nhất gần đánh dấu locus (RM10694)và thích hợp gen thành phần tại các nontargetloci và vượt qua với cha mẹ người nhậnđể phát triển thế hệ tiếp theo. Được lựa chọnNhà máy BC2 và BC3 được self-pollinated chotiếp tục phân tích.2.2. phân tử đánh dấu phân tíchDNA được chiết xuất từ lá chưa thành niên củanhà máy 2 tuần tuổi sử dụng một giao thức sửa đổi nhưMô tả bởi Zheng et al. (1995) [18]. PCR làthực hiện trong 10 ml phản ứng có chứa 5-25ng của DNA mẫu, 1 ml 10 X TB bộ đệm(có chứa 200 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mMKCl, 15 mM MgCl2), 1 ml 1 mM dNTP, 0,50ml mỗi của 5 μm chuyển tiếp và đảo ngược lớp lótvà 0,25 ML Taq DNA polymerase (4 U / ml)bằng cách sử dụng một MJNghiên cứu đơn hoặc kép 96-cũng nhiệtngười đạp xe máy. Sau khi ban đầu denaturation cho 5 phút tại94° C, mỗi chu kỳ bao gồm 1 phút denaturationtại 94° C, 1 phút ủ tại 55° C, và 2 phútphần mở rộng ở 72° C với một phần mở rộng cuối cùng cho 5phút tại 72° C vào cuối của chu kỳ 35. Đảng Cộng sản Romaniasản phẩm đã được trộn lẫn với bromophenol màu xanhgel nhuộm tải và đã được phân tíchđiện trên 8% polyacrylamide gel sử dụngmini dọc polyacrylamide gel caothông qua hướng dẫn sử dụng gen (CBS khoa họcCo Inc, CA, USA). Các gel được nhuộm màu trong0,5 mg/ml ethidium bromua và đãtài liệu sử dụng Alpha Imager 1220 (AlphaInnotech, CA, Hoa Kỳ). Microsatellite hoặc đơn giảnsequence repeat (SSR) markers were used forselection [19]. 90 L.H. Linh et al. / VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 28 (2012) 87-99 Figure 1. The scheme of applying MABC to improve salt tolerance in Bac Thom 7 cultivar. Table 1. Details of markers for foreground and recombinant selection L.H. Linh et al. / VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 28 (2012) 87-99 912.3. Foreground and recombinant selection At the initial stages of the experiment, forselection of the Saltol locus (foreground), thereported rice microsatellite (RM) markersRM493 and RM3412b, which were found to betightly linked to Saltol was used for foregroundselection. For franking markers used forrecombinant selection, about 5 Mb region of theSaltol region was targeted. Four polymophicmicrosatellite markers (RM1287, RM10694,RM562, RM7075) were identified forrecombinant selection (Table 1, Fig. 2).2.4. Background selection Microsatellite markers unlinked to Saltolcovering all the chromosomes including theSaltol carrier chromosome 1, that werepolymorphic between the two parents, wereused for background selection to recover therecipient genome (Fig. 3). Based on thepolymorphic information, initially evenlyspaced microsatellite markers were selected perchromosome. At least four polymorphicmicrosatellite markers per chromosome wereused. The microsatellite markers that revealedfixed (homozygous) alleles at nontarget loci atone generation were not screened at the next
BC generation. Only those markers that were
not fixed for the recurrent parent allele were
analyzed in the following generations. For the
selected plants from BC2F1 and BC3F1, an
additional 84 microsatellite markers were used
to check the fixation of the recipient genome.
2.5. Screening for agronomic traits
The BC3F1 plants with the parents, Bac
Thom 7 and FL478 were grown in a field at the
Thanh Tri, Hanoi, Vietnam. The plants were
laid in a 20 x 15 cm distance and evaluated for
12 traits: 1) Days to heading (dth) were
evaluated as the number of days from sowing
until the panicle headed; 2) Plant height (ph)
was measured in centimeters from the soil
surface to the tip of the tallest panicle (awns
excluded); 3) Panicle length (pl) was measured
in centimeters from the neck to the panicle tip;
4) Panicle number (pn) was calculated as the
number of panicles per plant; 5) 1,000 seed
weight (tsw) was measured in grams as the
weight of 1,000 fully filled seeds per plant; 6)
Primary branch number (pb) was estimated as
the number of primary branches per panicle; 7)
Secondary branch number (sb) was estimated as
the number of secondary branch per panicle; 8)
Seed per panicle (sp) was calculated as the
number of fully filled seed per panicle; 9)
Spikelets per panicle (spp) were calculated as
the number of spikelets per panicle.
2.6. Statistical analyses
The molecular weights of the different
alleles were calculated by Alpha Ease Fc 5.0
software. The marker data was analyzed using
the software Graphical Genotyper [20]. The
homozygous recipient allele, homozygous
dominant allele and heterozygous allele were
scored as ‘A’, ‘B’ and ‘H’, respectively. The
percent markers homozygous for recipient
parent (%A) and the percent recipient alleles
including heterozygous plants (%R) were
calculated. All experimental analyses of the
agronomic traits were performed in a
completely randomized design with at least
thrice. Data were analyzed with the use of the
Duncan’s multiple-range test (P<0.05). 92 L.H. Linh et al. / VNU Journal of Science, Natural Sciences and Techno

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu thực vật và vượt kế hoạch
Đề án xây dựng nhà máy
vật liệu sử dụng trong nghiên cứu này được tóm tắt trong
Hình 1. Một muối cao FL478 chịu (IR
66946-3R-178-1-1) đã được sử dụng như các nhà tài trợ của
Saltol QTLs, trong khi Bắc Thom 7 (O. sativa
indica spp.), một phát triển Việt phổ biến
giống ưu tú với chất lượng cao đã được sử dụng như là
cha mẹ người nhận. Có tổng cộng 477 SSR marker
phân bố ở 12 nhiễm sắc thể bao gồm cả
tiền cảnh, tái tổ hợp và nền
dấu đã được sàng lọc. Đối với các chương trình MABC,
Bắc Thơm 7 được lai với FL478 để có được
hạt giống F1 (Fig. 1). F1 được backcrossed với
Bắc Thơm 7 để có được một số lượng lớn các BC1F1
hạt. Trong thế hệ BC1F1, nhà máy cá nhân
mà là dị hợp tử ở các locus Saltol đã
xác định giảm quy mô dân số cho
sàng lọc thêm (lựa chọn foreground). Từ
các nhà máy cá nhân mà là dị hợp tử
Saltol, những người đã đồng hợp tử cho các
allele nhận tại một marker locus (RM10825)
distally Franking các locus Saltol (tức là
tái tổ hợp) đã được xác định. Chúng tôi gọi đây là
"lựa chọn tái tổ hợp" [17]. Một số sử dụng
dấu hiệu chi tiết được trình bày trong Bảng 1. Từ
các nhà máy tái tổ hợp, cá nhân với
số lượng ít nhất các mốc từ các nhà tài trợ
bộ gen đã được lựa chọn (lựa chọn background).
Trong thế hệ thứ hai và thứ ba trước Công nguyên, các
chiến lược đó đã được theo sau để lựa chọn
nhà máy cá nhân với các allele mong muốn
kết hợp ở các locus mục tiêu bao gồm
lựa chọn để tái tổ hợp giữa Saltol và
các marker locus vực gần gần (RM10694)
và thành phần di truyền thích hợp tại nontarget
loci và lai với phụ huynh nhận
để phát triển thế hệ tiếp theo. Các lựa chọn
BC2 và BC3 cây này tự thụ phấn cho
phân tích thêm.
2.2. Phân tích marker phân tử
DNA được chiết xuất từ lá non
cây 2 tuần tuổi sử dụng một giao thức sửa đổi như
mô tả bởi Zheng et al. (1995) [18]. PCR được
thực hiện trong 10 ml phản ứng có chứa 5-25
ng ADN khuôn, 1 ml 10 X đệm TB
(chứa 200 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM
KCl, 15 mM MgCl2), 1 ml 1 mM dNTP, 0,50
ml mỗi 5 mM phía trước và ngược mồi
và 0,25 ml Taq DNA polymerase (4 U / ml)
bằng cách sử dụng một MJ
Research đơn hoặc kép 96-cũng nhiệt
lọc. Sau khi biến tính ban đầu trong 5 phút ở
94 ° C, mỗi chu kỳ gồm 1 phút biến tính
ở 94 ° C, 1 phút ủ ở 55 ° C, và 2 phút
mở rộng ở 72 ° C với một phần mở rộng cuối cùng cho 5
phút ở 72 ° C tại cuối 35 chu kỳ. Các PCR
sản phẩm đã được pha trộn với bromophenol xanh
nhuộm gel tải và được phân tích bằng
điện di trên gel polyacrylamide 8% sử dụng
nhỏ gel polyacrylamide thẳng đứng cho cao
thông dụng kiểu gen (CBS Scientific
Co. Inc., CA, USA). Các gel được nhuộm màu trong
0,5 mg / ml ethidium bromide và được
ghi nhận bằng Alpha Imager 1220 (Alpha
Innotech, CA, USA). Microsatellite hoặc đơn giản
lặp lại liên tục (SSR) đánh dấu được sử dụng để
lựa chọn [19]. 90 LH Linh et al. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 28 (2012) 87-99
Hình 1. Đề án áp dụng MABC để cải thiện dung nạp muối ở Bắc Thơm 7 cây trồng.
Bảng 1. Thông tin chi tiết của các dấu hiệu cho foreground và lựa chọn tái tổ hợp LH Linh et al . / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 28 (2012) 87-99 91
2.3. Foreground và lựa chọn tái tổ hợp
Ở giai đoạn ban đầu của thí nghiệm, cho
lựa chọn của các locus Saltol (foreground), các
microsatellite gạo báo cáo (RM) đánh dấu
RM493 và RM3412b, được tìm thấy được
liên kết chặt chẽ với Saltol đã được sử dụng cho foreground
lựa chọn. Để đánh dấu miễn tem bưu điện được sử dụng để
lựa chọn tái tổ hợp, khoảng 5 Mb khu vực của
khu vực được nhắm mục tiêu Saltol. Bốn polymophic
dấu microsatellite (RM1287, RM10694,
RM562, RM7075) đã được xác định cho
lựa chọn tái tổ hợp (Bảng 1, Hình. 2).
2.4. Lựa chọn Background
dấu microsatellite bỏ liên kết để Saltol
bao gồm tất cả các nhiễm sắc thể bao gồm cả các
nhà cung cấp dịch Saltol nhiễm sắc thể 1, đó là
đa hình giữa hai bố mẹ, đã được
sử dụng để lựa chọn nền để phục hồi các
hệ gen người nhận (Hình. 3). Dựa trên các
thông tin đa hình, ban đầu đều
đánh dấu microsatellite khoảng cách đã được lựa chọn cho mỗi
nhiễm sắc thể. Ít nhất bốn polymorphic
dấu microsatellite mỗi nhiễm sắc thể được
sử dụng. Các dấu microsatellite rằng tiết lộ
cố định (đồng hợp tử) alen ở locus nontarget ở
một thế hệ không được trình chiếu tại tiếp theo
thế hệ BC. Chỉ có những dấu hiệu đó đã
không cố định cho phụ huynh allele tái phát đã được
phân tích trong các thế hệ sau. Đối với các
nhà máy được lựa chọn từ BC2F1 và BC3F1, một
thêm 84 microsatellite marker được sử dụng
để kiểm tra các sự cố định của bộ gen người nhận.
2.5. Sàng lọc các tính trạng nông học
Cây BC3F1 với cha mẹ, Bắc
Thơm 7 và FL478 được trồng trong một lĩnh vực tại
Thanh Trì, Hà Nội, Việt Nam. Các cây được
đặt trong một khoảng cách 20 x 15 cm và đánh giá cho
12 đặc điểm: 1) Days nhóm (DTH) được
đánh giá là số ngày từ gieo
đến khi bông đứng đầu; 2) Chiều cao cây (ph)
được đo bằng cm từ đất
bề mặt mũi của chùy cao nhất (awns
túc); 3) chiều dài bông (pl) được đo
bằng cm từ cổ đến đầu chùy;
4) số chùy (pn) đã được tính toán như
số bông trên cây; 5) 1.000 hạt giống
trọng lượng (tsw) được đo bằng gam là
trọng lượng 1.000 hạt điền đầy đủ một nhà máy; 6)
số chi nhánh chính (pb) được ước tính
số lượng các chi nhánh chính mỗi chùy; 7)
số chi nhánh thứ cấp (sb) được ước tính
số lượng các chi nhánh thứ cấp mỗi chùy; 8)
Seed mỗi chùy (sp) đã được tính toán như
số lượng hạt giống hoàn toàn đầy mỗi chùy; 9)
bông con mỗi chùy (spp) được tính toán như
số lượng bông con mỗi chùy.
2.6. Phân tích thống kê
cho thấy khối lượng phân tử khác nhau của
alen được tính bằng 5,0 Alpha Dễ Fc
phần mềm. Các dữ liệu được phân tích bằng dấu
các phần mềm đồ họa Genotyper [20]. Các
alen người nhận đồng hợp tử, hợp tử
alen trội và alen dị hợp được
ghi là 'A', 'B' và 'H', tương ứng. Các
dấu phần trăm đồng hợp tử cho người nhận
cha mẹ (% A) và các alen trăm người nhận
bao gồm các nhà máy dị hợp tử (% R) được
tính toán. Tất cả các phân tích thực nghiệm về các
tính trạng nông học đã được thực hiện trong một
thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên với ít nhất
ba lần. Dữ liệu được phân tích với việc sử dụng các
thử nghiệm nhiều tầm của Duncan (P <0,05). 92 LH Linh et al. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Techno