100 ng template DNA, 0.4 μM of each

100 ng template DNA, 0.4 μM of each primer, and 0.15 μM of the TaqMan probe. Amplifications were performed on a Line Gene II PCR device (Bioer Technology Co., Hangzhou, China) and a thermal cycling protocol of 95 ◦ C for 15 min followed by 40 cycles with 15 s denaturation at 95 ◦ C, and
1 min annealing/elongation at 60 ◦ C was applied. Reactions were replicated at least twice per experiment and experiments were replicated 3 times to verify the results.

PCR primers specificity and sensitivity test
The specificity of each species specific primer was confirmed by the amplification of 100 ng of chicken, turkey, horse, donkey, pork, bovine, and ovine genomic DNA, and a negative control without DNA. Each assay was tested against DNA from all seven species, that is, against its target species and the 6 remaining species to confirm assay specificity. In sensitivity tests of the specific primers and probes, PCR amplifications were examined between specific primers and 10-fold serial dilutions of DNAs isolated from the meat of each target species ranging from 100 to 0.0001 ng/μL water. The standard curves for both detection systems were con- structed by using the ct value obtained from the corresponding DNA concentration.

Conventional PCR protocol
The PCR amplification reaction was performed in a 50 μL vol- ume containing 100 ng template DNA, 25 μL commercial PCR master mix (Qiagen), and 0.8 μM of each primer. After an initial denaturation step at 94 ◦ C for 10 min, 40 thermal cycles were car- ried out (Line Gene II PCR) as follows: melting at 94 ◦ C for 50 s, annealing at 53 and 55 ◦ C for chicken and turkey, respectively, ex- tension at 72 ◦ C for 1 min, with a final elongation step at 72 ◦ C for
10 min. The products of PCR amplification were electrophoreti- cally determined on a 2.5% agarose gel containing ethidium bro- mide (0.5 μg/mL) in 1XTAE buffer (Tris–Acetate–EDTA buffer) and visualized by UV transillumination.

Results
In this study, conventional PCR and real-time PCR assays, based on the amplification of fragments of the mitochondrial ND2 gene, were developed and evaluated for the detection and quantification of chicken and turkey meat in raw and heat-treated meat mixtures. Species specific primers and TaqMan probes were designed, and amplification conditions were optimized by using these primers and probes.

Specificity of the TaqMan probe systems
The specificity of both detection systems were tested for 7 common and commercial meat species; chicken, turkey, pork, horse, donkey, bovine, and sheep. The primers generated species specific fragments of 80 and 137 bp length for chicken and turkey, respectively, whereas no cross-reaction was obtained with any of the nontarget species DNA (Table 1). The common primer–probe system amplified a 74 bp fragment and calculated ct values of 15.98,
16.10, 15.61, 15.03, 18.14, 15.78, and 18.57 from horse, donkey, pork, bovine, ovine, chicken, and turkey mitochondrial DNAs, respectively.

Kết quả (Việt) 1:

100 ng mẫu DNA, cách 0.4 μM của mỗi mồi và 0,15 μM thăm dò TaqMan. Amplifications đã được thực hiện trên một thiết bị dòng Gene II Đảng Cộng sản Romania (Bioer công nghệ công ty, hàng Châu, Trung Quốc) và một giao thức đi xe đạp nhiệt của 95 ◦ C cho 15 phút sau đó là các chu kỳ 40 với 15 s denaturation tại 95 ◦ C, và1 phút làm cho deo/kéo dài tại 60 ◦ C đã được áp dụng. Phản ứng được nhân rộng ít nhất hai lần một thử nghiệm và thử nghiệm đã được nhân rộng 3 lần để xác minh kết quả.Đảng Cộng sản Romania lớp lót đặc trưng và độ nhạy kiểm traCác đặc trưng của mỗi mồi loài cụ thể đã được xác nhận bởi khuếch đại của 100 của gà, Thổ Nhĩ Kỳ, Cưỡi, lừa, thịt lợn, bò, và lông gen DNA, và một điều khiển tiêu cực mà không có DNA. Mỗi khảo nghiệm được thử nghiệm chống lại DNA từ tất cả 7 loài, có nghĩa là, đối với các loài mục tiêu và 6 còn lại loài để xác nhận khảo nghiệm đặc trưng. Trong bài kiểm tra độ nhạy của cụ thể chất nền, mồi và đầu dò, Đảng Cộng sản Romania amplifications đã được kiểm tra giữa cụ thể chất nền, mồi và 10-fold dilutions nối tiếp của DNAs cô lập từ thịt mỗi loài mục tiêu khác nhau, từ 100 đến 0.0001 ng/μL nước. Các đường cong tiêu chuẩn cho cả hai hệ thống nhận là con-structed bằng cách sử dụng giá trị ct thu được từ nồng độ DNA tương ứng.Thông thường PCR giao thứcThe PCR amplification reaction was performed in a 50 μL vol- ume containing 100 ng template DNA, 25 μL commercial PCR master mix (Qiagen), and 0.8 μM of each primer. After an initial denaturation step at 94 ◦ C for 10 min, 40 thermal cycles were car- ried out (Line Gene II PCR) as follows: melting at 94 ◦ C for 50 s, annealing at 53 and 55 ◦ C for chicken and turkey, respectively, ex- tension at 72 ◦ C for 1 min, with a final elongation step at 72 ◦ C for10 min. The products of PCR amplification were electrophoreti- cally determined on a 2.5% agarose gel containing ethidium bro- mide (0.5 μg/mL) in 1XTAE buffer (Tris–Acetate–EDTA buffer) and visualized by UV transillumination.ResultsIn this study, conventional PCR and real-time PCR assays, based on the amplification of fragments of the mitochondrial ND2 gene, were developed and evaluated for the detection and quantification of chicken and turkey meat in raw and heat-treated meat mixtures. Species specific primers and TaqMan probes were designed, and amplification conditions were optimized by using these primers and probes.Specificity of the TaqMan probe systemsThe specificity of both detection systems were tested for 7 common and commercial meat species; chicken, turkey, pork, horse, donkey, bovine, and sheep. The primers generated species specific fragments of 80 and 137 bp length for chicken and turkey, respectively, whereas no cross-reaction was obtained with any of the nontarget species DNA (Table 1). The common primer–probe system amplified a 74 bp fragment and calculated ct values of 15.98,16.10, 15.61, 15.03, 18.14, 15.78, and 18.57 from horse, donkey, pork, bovine, ovine, chicken, and turkey mitochondrial DNAs, respectively.

Kết quả (Việt) 2:

100 ng mẫu DNA, 0,4 mM của mỗi mồi, và 0,15 mM của tàu thăm dò TaqMan. Khuyếch đại được thực hiện trên một thiết bị dòng Gene II PCR (Bioer Technology Co., Hàng Châu, Trung Quốc) và một giao thức đi xe đạp nhiệt của 95 ◦ C trong 15 phút tiếp theo là 40 chu kỳ với 15 s biến tính ở 95 ◦ C, và
1 phút ủ / kéo dài ở 60 ◦ C đã được áp dụng. Phản ứng đã được nhân rộng ít nhất hai lần mỗi thử nghiệm và thí nghiệm được lặp lại 3 lần để xác minh các kết quả. PCR mồi đặc hiệu và độ nhạy kiểm tra đặc hiệu của từng loài mồi cụ thể đã được xác nhận bởi sự khuếch đại của 100 ng gà, gà tây, ngựa, lừa, thịt lợn , trâu, bò, cừu và DNA của bộ gen, và một điều khiển âm không có ADN. Mỗi thí nghiệm được thử nghiệm chống DNA từ tất cả bảy loài, có nghĩa là, đối với các loài mục tiêu của nó và 6 loài còn lại để xác nhận khảo nghiệm đặc hiệu. Trong các thử nghiệm độ nhạy của mồi và thăm dò cụ thể, khuyếch đại PCR đã được kiểm tra giữa cặp mồi đặc và pha loãng nối tiếp 10 lần của ADN phân lập từ thịt của mỗi loài mục tiêu khác nhau, 100-0,0001 ng / ml nước. Các đường cong tiêu chuẩn cho cả hai hệ thống phát hiện được con- structed bằng cách sử dụng các giá trị thu được từ ct nồng độ DNA tương ứng. giao thức PCR thông thường , phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trong 50 ml thể tích của lượng chứa 100 ng mẫu DNA, 25 ml tổng PCR thương mại trộn (Qiagen), và 0,8 mM của mỗi mồi. Sau một bước biến tính ban đầu ở 94 ◦ C trong 10 phút, 40 chu kỳ nhiệt là car- Ried ra (Line Gene II PCR) như sau: nóng chảy ở 94 ◦ C cho 50 s, ủ ở 53 và 55 ◦ C cho gà và gà tây , tương ứng, căng thẳng cựu ở 72 ◦ C trong 1 phút, với một bước kéo dài cuối cùng ở 72 ◦ C cho 10 phút. Các sản phẩm khuếch đại PCR là Cally electrophoreti- xác định trên gel agarose 2,5% chứa ethidium bro- mide (0,5 mg / ml) trong 1XTAE đệm (Tris-Acetate-EDTA đệm) và hình dung bằng cách transillumination UV. Kết quả nghiên cứu này, thông thường PCR và các xét nghiệm PCR thời gian thực, dựa trên sự khuếch đại của mảnh vỡ của các gen ty thể ND2, được phát triển và đánh giá để phát hiện và định lượng của gà thịt và gà tây trong hỗn hợp thịt sống và được xử lý nhiệt. Loài mồi và mẫu dò TaqMan cụ thể đã được thiết kế và điều kiện khuếch đại đã được tối ưu hóa bằng cách sử dụng các đoạn mồi và đầu dò. đặc hiệu của các hệ thống thăm dò TaqMan Độ đặc của cả hai hệ thống phát hiện đã được thử nghiệm trong 7 loài thịt phổ biến và thương mại; thịt gà, gà tây, thịt lợn, ngựa, lừa, bò và cừu. Các mồi tạo ra loài mảnh cụ thể của 80 và 137 bp dài cho gà và gà tây, tương ứng, trong khi không có phản ứng chéo đã thu được với bất kỳ của các loài nontarget DNA (Bảng 1). Hệ thống sơn lót đầu dò thường được khuếch đại một đoạn 74 bp và tính toán giá trị của ct 15.98, 16.10, 15,61, 15.03, 18.14, 15.78, và từ 18,57 ngựa, lừa, thịt lợn, trâu, bò, cừu, gà, gà tây và DNA ti thể, tương ứng.