CHAPTER 5XYLANASES: MOLECULAR PROPE

CHAPTER 5

XYLANASES: MOLECULAR PROPERTIES

AND APPLICATIONS

F. I. JAVIER PASTOR1∗, ÓSCAR GALLARDO1, JULIA SANZ-APARICIO2

AND PILAR DÍAZ1

1Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona, Spain and

2Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, Madrid, Spain

∗[e-mail]

1. INTRODUCTION

The plant cell wall is a highly organized network of lignocellulose, made up of

cellulose and cross-linked glycans embedded in a gel matrix of pectic substances

and reinforced with structural proteins and aromatic compounds. Cellulose and

hemicelluloses are the major components of cell wall polysaccharides, with hemicel-
luloses representing up to 20–35% of the total lignocellulosic biomass (de Vries and

Visser, 2001). The major hemicellulose in cereals and hardwoods is xylan, while

the main hemicellulose in softwoods is galactoglucomannan. Other less abundant

hemicelluloses include glucomannan, xyloglucan, arabinogalactan and arabinan,

the latter polymers often being found as side chains of pectins (de Vries and

Visser, 2001). The degradation of hemicelluloses is mostly carried out by micro-
organisms that can be found either free in nature or as a part of the digestive tract

of higher animals. The hydrolytic enzymes produced by these micro-organisms are

the key components for the degradation of plant biomass and carbon flow in nature

(Shallom and Shoham, 2003).

Xylan is a major structural component of plant cell walls and, after cellulose, is

the second most abundant renewable polysaccharide in nature (Collins et al., 2005).

It is the main hemicellulose in hardwoods from angiosperms and is less abundant in

softwoods from gymnosperms, accounting for approximately 15–30% and 7–12%

of their total dry weights, respectively (Wong et al., 1988). In woody tissues

xylan is located mainly in the secondary cell wall where, together with lignin,

it forms an amorphous matrix that includes and embeds cellulose microfibrils.

J. Polaina and A.P. MacCabe (eds.), Industrial Enzymes, 65–82.

© 2007 Springer.

65

66 PASTOR ET AL.

Xylan interacts with lignin and cellulose via covalent and non-covalent linkages,

these interactions being of importance for both protecting the cellulose microfibrils

against biodegradation and maintaining the structural integrity of cell walls.

Xylan is a complex polysaccharide composed of a backbone of -1,4-linked

xylopyranosyl residues that, depending on the plant source, can be variably

substituted by side chains of arabinosyl, glucuronosyl, methylglucuronosyl, acetyl,

feruloyl and p-coumaroyl residues. Although homoxylans have been found in

some plants and seaweeds, in the latter case also containing xylose -1,3 linkages,

xylans containing exclusively xylose residues are not widespread in nature (Beg

et al., 2001). Xylan from most plant sources occurs as a heteropolysaccharide

and the terms glucuronoxylan and glucuronoarabinoxylan are commonly used to

describe xylan from hardwoods and softwoods, respectively. These two types of

xylan have 4-O-methyl -D-glucuronic acid residues attached to C-2 of the xylose

backbone units. Hardwoods have this substitution on approximately 10% of the

xylose residues, while in softwoods around 20% of xylose residues are branched

with glucuronic acid. Softwood xylan is also substituted with -l-arabinofuranose

on C-3 of approximately 13% of the xylose backbone residues (Coughlan and

Hazlewood, 1993). The degree of polymerization is variable among xylans, being

greater in hardwoods (150–200) than in softwoods (70–130) (Kulkarni et al., 1999).

While xylan from softwoods is not acetylated, xylan from hardwoods is highly acety-
lated, this substitution occurring on around 70% of the xylose units at C-2, C-3 or

both (Coughlan and Hazlewood, 1993). The presence of acetyl groups makes xylan

significantly more soluble in water (Biely, 1985). Xylan from grasses is usually

referred to as arabinoxylan because of its large content in arabinosyl residues, which

are linked to xylose at C-2 or C-3 or both. This xylan is acetylated and also has

glucuronic acid present, albeit at a lower content compared to hardwoods. Feruloyl

and coumaroyl residues ester-linked to C-5 of arabinose side chains are found in

xylans from different sources, and may be involved in the covalent cross-linking

of xylan molecules with lignin or with other xylan molecules. As a consequence of

all these features, xylans constitute a very heterogeneous group of polysaccharides

showing microheterogeneity with respect to the degree and nature of branching in

each category. Xylans containing rhamnose and galactose residues have also been

described from different plant sources (Wong et al., 1988).

2. ENZYMATIC DEGRADATION OF XYLAN

Due its heterogeneity and complex nature, the complete breakdown of xylan requires

the action of a large variety of hydrolytic enzymes (Biely, 1985; Coughlan and

Hazlewood, 1993). These enzymes can be classified into two main groups: those

acting on the xylose backbone, and those cleaving the side chains. Degradation of

the xylose backbone depends on xylanases, that cleave bonds within the polymer,

and -xylosidases that release xylose units from xylobiose and xylooligomers.

Removal of xylan side chains is catalysed by -l-arabinofuranosidases, -d-
glucuronidases, acetyl xylan esterases, ferulic acid esterases and p-coumaric acid

esterases (Fig. 1). Xylan degradation is quite widespread among saprophytic

XYLANASES: MOLECULAR PROPERTIES AND APPLICATIONS 67

Figure 1. Structure of xylan and the sites of attack by xylanolytic enzymes. The backbone of xylan

chains is composed of -1,4-linked xylopyranose residues. This backbone can be variously substituted by

side chains of arabinosyl, glucuronosyl, methylglucuronosyl, acetyl, feruloyl and p-coumaroyl residues.

Hydrolysis of the xylan backbone is carried out by xylanases that hydrolyse internal linkages in xylan,

and -xylosidases that release xylose units from xylobiose and xylooligomers, while removal of xylan

side chains is catalysed by -l-arabinofuranosidases, -d-glucuronidases, acetyl xylan esterases, ferulic

acid esterases and p-coumaric acid esterases

micro-organisms, including bacteria and fungi, as well as in the rumen micro-
biota, that possess complete xylanolytic enzyme systems (Biely, 1985; Sunna

and Antranikian, 1997; Krause et al., 2003). Synergism between xylan degrading

enzymes has been extensively studied and found to frequently occur between

xylanases and side chain cleaving enzymes, between xylanases and -xylosidases,

and also between different xylanases (Coughlan et al., 1993; de Vries et al., 2000).

In this way, xylan degradation can proceed despite that the access of xylanases to

their targets in the xylan backbone may be obstructed by side chain substituents

and that these substituents may be more readily released from xylan fragments than

from the polymeric substrate.

3. XYLANASES

3.1. Function, Expression and Multiplicity

Xylanases (endo--1,4-xylanases, EC 3.2.1.8) cleave the xylan backbone into

smaller oligosaccharides. They are the key enzymes for xylan degradation and

differ in their specificities toward the xylan polymer. Many cleave only at unsub-
stituted regions whereas others have a requirement for side chains in the vicinity

of the cleaved bonds (Coughlan and Hazlewood, 1993). Most xylanases are also

active on xylooligomers of degree of polymerization greater than 2, showing

increasing affinity for xylooligomers of increasing length. Xylanases are endo

type enzymes that hydrolyse internal linkages in xylan and act by a random

attack mechanism yielding a mixture of xylooligosaccharides from the polymer.

68 PASTOR ET AL.

Nevertheless, characterization of Aeromonas xylanases which produce only one

oligosaccharide type as a reaction product from xylan suggested an alternative

mode of hydrolysis: an exo type mechanism from one end of the polymer

(Kubata et al., 1995) similar to the processive mode of action of exocellulases in

cellulose degradation (Lynd et al., 2002). However, as this type of mechanism

would first require depletion of the side chains from xylan, the occurrence of true

exoxylanases for xylan degradation seems unlikely.

As xylan is a large polymer that cannot penetrate into cells, xylanases have to

be secreted to the extracellular environment to reach and hydrolyse it. Generally,

xylanases are induced in most micro-organisms during their growth on substrates

containing xylan. Small soluble oligosaccharides released from xylan by the action

of low levels of constitutively produced enzymes are transported inside cells where

they induce xylanase expression (Kulkarni et al., 1999). In the fungus Cryptococcus

albidus, xylobiose is considered to be the natural inducer or the direct precursor of

compounds that induce xylanase expression (Biely, 1985). Regulation of xylanase

synthesis is often coordinated with the expression of cellulases, as in the case

of Aspergillus in which several regulatory proteins including the transcriptional

activator XlnR and the carbon catabolite repressor CreA have been identified and

characterized (de Vries and Visser, 2001). Although most xylanases are extra-
cellular enzymes, usually secreted by the Sec-dependent pathway, periplasmic

xylanases have been described in some rumen bacteria and in Cellvibrio mixtus

(Fontes et al., 2000). These periplasmic xylanases are probably involved in the

breakdown of large xylooligosaccharides and protected in this location from extra-
cellular proteases. Recently, a cytoplasmic xylanase that may represent a new type of

enzymes involved in xylan degradation has been characterized from Paenibacillus

barcinonensis (Gallardo et al., 2003). In common with three other xylanases charac-
terized from Bacillus and Aeromonas, the P. barcinonensis enzyme lacks a signal

peptide for export outside the cytoplasm. These

Kết quả (Việt) 2:

CHƯƠNG 5 XYLANASES: TÍNH CHẤT PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG F. I. JAVIER PASTOR1 *, Oscar GALLARDO1, JULIA Sanz-APARICIO2 và Pilar DÍAZ1 1Khoa Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Barcelona, ​​Tây Ban Nha và 2Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, Madrid, Tây Ban Nha *[e-mail]~~V 1. GIỚI THIỆU Các bức tường tế bào thực vật là một mạng lưới có tổ chức cao của lignocellulose, tạo thành cellulose và liên kết ngang polisacarit nhúng trong một ma trận gel của chất pectic và được gia cố bằng các protein cấu trúc và các hợp chất thơm. Cellulose và hemicelluloses là những thành phần chính của polysaccharides vách tế bào, với hemicel- luloses đại diện lên đến 20-35% tổng số sinh khối lignocellulose (de Vries và Visser, 2001). Các hemicellulose lớn trong ngũ cốc và các loại gỗ là xylan, trong khi các hemicellulose chính trong gỗ mềm là galactoglucomannan. Ít phong phú khác hemicelluloses bao gồm Glucomannan, xyloglucan, arabinogalactan và arabinan, các polime sau này thường được tìm thấy như là chuỗi bên của pectin (de Vries và Visser, 2001). Sự xuống cấp của hemicelluloses chủ yếu được thực hiện bởi vi sinh vật có thể được tìm thấy hoặc tự do trong tự nhiên hoặc là một phần của đường tiêu hóa của động vật bậc cao. Các enzyme thủy phân được sản xuất bởi các vi sinh vật này là thành phần quan trọng cho sự xuống cấp của sinh khối thực vật và lưu lượng carbon trong tự nhiên (Shallom và Shoham, 2003). Xylan là một thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật và, sau cellulose, là thứ hai nhất polysaccharide tái tạo dồi dào trong tự nhiên (Collins et al., 2005). Đây là hemicellulose chính trong các loại gỗ từ cây hạt kín và ít nhiều trong gỗ mềm từ cây hạt trần, chiếm khoảng 15-30% và 7-12% tổng trọng lượng khô của họ , tương ứng (Wong et al., 1988). Trong gỗ mô xylan nằm chủ yếu ở thành tế bào thứ cấp nơi, cùng với lignin, nó tạo thành một ma trận vô định hình bao gồm và nhúng microfibrils cellulose. J. Polaina và AP MacCabe (eds.), Enzyme công nghiệp, 65-82. © 2007 Springer. 65 66 mục sư ET AL. Xylan tương tác với lignin và cellulose thông qua mối liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị, những tương tác này là quan trọng đối với cả hai bảo vệ cellulose microfibrils chống phân hủy sinh học và duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của màng tế bào. xylan là một polysaccharide phức tạp bao gồm một xương sống của -1,4 liên kết dư xylopyranosyl đó, tùy thuộc vào nguồn gốc thực vật, có thể được variably thay thế bằng chuỗi bên của arabinosyl, glucuronosyl, methylglucuronosyl, acetyl, feruloyl và p-coumaroyl dư lượng. Mặc dù homoxylans đã được tìm thấy trong một số thực vật và rong biển, trong các trường hợp sau này cũng chứa xylose -1,3 mối liên kết, xylans có chứa dư lượng độc quyền xylose là không phổ biến rộng rãi trong tự nhiên (Beg et al., 2001). Xylan từ hầu hết các nguồn thực vật xảy ra như một heteropolysaccharide và các điều khoản glucuronoxylan và glucuronoarabinoxylan thường được sử dụng để mô tả xylan từ gỗ cứng và gỗ mềm, tương ứng. Hai loại xylan có 4-O-methyl-D-glucuronic dư lượng axit thuộc C-2 của xylose đơn vị xương sống. Gỗ cứng có thay thế này vào khoảng 10% dư lượng xylose, trong khi gỗ mềm khoảng 20% dư lượng xylose được phân nhánh với acid glucuronic. Xylan gỗ mềm cũng được thay thế bằng -l-arabinofuranose trên C-3 của khoảng 13% số dư lượng xylose xương sống (Coughlan và Hazlewood, 1993). Mức độ trùng hợp là biến số xylans, là trong các loại gỗ cứng (150-200) lớn hơn so với gỗ mềm (70-130) (Kulkarni et al., 1999). Trong khi xylan từ gỗ mềm không được acetyl hóa, xylan từ gỗ cứng là rất cao acety- lated, thay thế này xảy ra vào khoảng 70% các đơn vị xylose tại C-2, C-3 hoặc cả hai (Coughlan và Hazlewood, 1993). Sự hiện diện của các nhóm acetyl làm xylan đáng kể hòa tan trong nước (Biely, 1985). Xylan từ cỏ thường được gọi tắt là arabinoxylan vì nội dung lớn của nó trong tàn dư arabinosyl, mà có liên quan đến xylose tại C-2, C-3 hoặc cả hai. Xylan này là axetyl hóa và cũng có glucuronic axit hiện nay, mặc dù ở một nội dung thấp hơn so với gỗ cứng. Feruloyl và dư lượng coumaroyl liên kết este với C-5 của chuỗi bên arabinose được tìm thấy trong xylans từ các nguồn khác nhau, và có thể được tham gia vào các cộng hóa trị liên kết chéo của các phân tử xylan với lignin hoặc với các phân tử xylan khác. Như một hệ quả của tất cả các tính năng này, xylans tạo thành một nhóm rất không đồng nhất của các polysaccharides thấy microheterogeneity đối với mức độ và tính chất của phân nhánh với mỗi loại. Xylans chứa rhamnose và galactose dư lượng cũng đã được mô tả từ các nguồn thực vật khác nhau (Wong et al, 1988).. 2. SUY THOÁI enzyme của xylan Do không đồng nhất và tính chất phức tạp, tình trạng hư xylan đòi hỏi những hành động của một lượng lớn các enzyme thủy phân (Biely, 1985; Coughlan và Hazlewood, 1993). Các men này có thể được phân thành hai nhóm chính: những tác động lên xương sống xylose, và những tách cầu chuỗi bên. Sự xuống cấp của xương sống xylose phụ thuộc vào xylanases, trái phiếu cleave bên trong polymer, và -xylosidases rằng các đơn vị phát hành xylose từ xylobiose và xylooligomers. Loại bỏ các chuỗi bên xylan được xúc tác bởi -l-arabinofuranosidases, -d- glucuronidases, acetyl esteraza xylan, esteraza axit ferulic và p-coumaric axit esteraza (Fig. 1). Suy thoái xylan là khá phổ biến trong các hoại sinh XYLANASES: TÍNH CHẤT PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG 67 Hình 1. Cấu trúc của xylan và các trang web bị tấn công bởi các enzyme xylanolytic. Xương sống của xylan chuỗi gồm -1,4 liên kết xylopyranose dư lượng. Xương sống này có thể được thay thế bằng nhiều cách khác nhau chuỗi bên của arabinosyl, glucuronosyl, methylglucuronosyl, acetyl, feruloyl và dư lượng p-coumaroyl. Thủy phân của xương sống xylan được thực hiện bởi xylanases rằng thủy phân các liên kết nội bộ trong xylan, và -xylosidases rằng các đơn vị phát hành xylose từ xylobiose và xylooligomers, trong khi loại bỏ các xylan chuỗi bên được xúc tác bởi -l-arabinofuranosidases, -d-glucuronidases, acetyl esteraza xylan, ferulic esteraza axit và axit p-coumaric esteraza vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn và nấm, cũng như trong dạ cỏ vi sinh vật, mà có đầy đủ các hệ thống enzyme xylanolytic (Biely, 1985; Sunna và Antranikian, 1997;. Krause et al, 2003). Sự đồng bộ giữa xylan xuống cấp enzyme đã được nghiên cứu rộng rãi và được thấy thường xuyên xảy ra giữa xylanases và chuỗi bên bóc enzyme, giữa xylanases và -xylosidases, và cũng giữa xylanases khác nhau (Coughlan et al 1993,;. De Vries et al., 2000). Bằng cách này, suy thoái xylan có thể tiến hành bất chấp rằng việc truy cập của xylanases đến mục tiêu của họ trong xương sống xylan có thể bị cản trở bởi thế chuỗi bên và các nhóm thế có thể được phát hành dễ dàng hơn từ các mảnh xylan hơn từ các chất nền polymer. 3. XYLANASES 3.1. Chức năng, biểu hiện và Multiplicity Xylanases (endo - 1,4-xylanases, EC 3.2.1.8) tách xương sống xylan thành oligosaccharides nhỏ hơn. Họ là những enzyme quan trọng cho quá trình suy xylan và khác nhau về đặc điểm riêng của họ đối với các polymer xylan. Nhiều cleave chỉ unsub- vùng stituted trong khi những người khác có một yêu cầu cho chuỗi bên trong vùng lân cận của các trái phiếu chẻ (Coughlan và Hazlewood, 1993). Hầu hết xylanases cũng đang hoạt động trên xylooligomers của mức độ trùng hợp lớn hơn 2, cho thấy tăng ái lực với xylooligomers chiều dài tăng. Xylanases là endo enzyme loại mà thủy phân các liên kết nội bộ trong xylan và hành động của một ngẫu nhiên cơ chế tấn công cho ra một hỗn hợp của xylooligosaccharides từ polymer. 68 mục sư ET AL. Tuy nhiên, đặc tính của xylanases Aeromonas mà chỉ sản xuất một loại oligosaccharide như một sản phẩm phản ứng từ xylan đề nghị một sự thay thế chế độ thủy phân: một cơ chế loại exo từ một đầu của polymer (Kubata et al., 1995) tương tự như chế độ processive hành động của exocellulases trong suy thoái cellulose (Lynd et al., 2002). Tuy nhiên, hình thức này ngày cơ chế đầu tiên sẽ yêu cầu sự suy giảm của các chuỗi bên từ xylan, sự xuất hiện của sự thật exoxylanases cho suy thoái xylan dường như khó xảy ra. Như xylan là một polymer lớn mà không thể xâm nhập vào các tế bào, xylanases phải được tiết ra môi trường ngoại bào tiếp cận và thủy phân nó. Nói chung, xylanases đang gây ra ở hầu hết các vi sinh vật trong quá trình tăng trưởng của họ trên các chất nền có chứa xylan. Oligosaccharides hòa tan nhỏ phát hành từ xylan bởi các hành động của các cấp thấp của enzym constitutively được vận chuyển vào trong tế bào mà họ gây ra biểu hiện xylanase (Kulkarni et al., 1999). Trong nấm Cryptococcus albidus, xylobiose được coi là các chất cảm ứng tự nhiên hoặc tiền thân trực tiếp của các hợp chất gây cảm ứng biểu hiện xylanase (Biely, 1985). Quy định của xylanase tổng hợp thường được phối hợp với các biểu hiện của cellulase, như trong trường hợp của Aspergillus trong đó một số protein quy định bao gồm các phiên mã activator XlnR và carbon catabolite repressor CREA đã được xác định và đặc trưng (de Vries và Visser, 2001). Mặc dù hầu hết xylanases là ngoại khóa men tế bào, thường tiết ra bởi các con đường Sec-phụ thuộc, periplasmic xylanases đã được mô tả trong một số vi khuẩn dạ cỏ và trong Cellvibrio mixtus (Fontes et al., 2000). Những xylanases periplasmic có lẽ liên quan đến các sự cố của xylooligosaccharides lớn và được bảo hộ tại vị trí này từ ngoại khóa protease tế bào. Gần đây, một xylanase tế bào chất mà có thể đại diện cho một loại mới của các enzym tham gia vào suy thoái xylan đã được đặc trưng từ Paenibacillus barcinonensis (Gallardo et al., 2003). Chung với ba xylanases khác charac terized từ Bacillus và Aeromonas, loại enzyme barcinonensis P. thiếu một tín hiệu peptide cho xuất khẩu bên ngoài tế bào chất. Những