Inefficient targeting of HCMV by si

Inefficient targeting of HCMV by single gRNAs selects for viral escape mutants after prolonged replication
Many single anti-HCMV gRNAs effectively impaired HCMV infection, preventing virus replication and spread up to 11 days post infection (Fig 3A). However, replication-competent virus emerged after prolonged culture of cells in the majority of gRNA expressing cells. This may be due to the outgrowth of virus variants that harbor CRISPR/Cas9-induced mutations that still allow for expression of functional proteins. To assess this, virus variants were isolated from two cultures of CRISPR-expressing cells that were infected at high MOI (0.5) and displayed outgrowth of virus after 21 days of culture (UL57 gRNA #1 and UL70 gRNA #4). Subsequent 454 sequencing of the targeted genes predominantly detected variants that maintained the correct reading frame of these two essential genes (Fig 4) as mostly deletions of complete codons (i.e. 3-6-9-12 bp, etc) were detected. We quantified the number of sequences with frameshift variants, and observed a clear depletion of these in the anti-HCMV gRNA expressing cells targeting essential genes (1,3% for UL57 #1, and 4,6% for UL70 #4) as compared to gRNAs targeting the nonessential genes US7 and US11 (83,5 and 85,8% respectively) (Fig 4A). Furthermore, the sequence complexity of the mutants selected upon UL57 and UL70 targeting was low (Fig 4B and 4C), suggesting selection of few ‘fit’ variants and subsequent expansion of these infectious mutants over time. To conclude, the CRISPR/Cas9-technology represents a promising strategy to impair HCMV replication; however, its successful application requires effective modification of the viral genome to avoid the emergence and selection of escape variants that bypass CRISPR/Cas9 editing.

Kết quả (Việt) 1:

Mục tiêu không hiệu quả của HCMV bởi gRNAs duy nhất lựa chọn cho virus thoát đột biến sau khi kéo dài rộngNhiều đơn anti-HCMV gRNAs có hiệu quả kém HCMV nhiễm trùng, ngăn ngừa virus nhân rộng và lan truyền lên đến 11 ngày đăng lây nhiễm (hình 3A). Tuy nhiên, có thẩm quyền nhân rộng vi rút nổi lên sau khi kéo dài văn hóa của các tế bào trong phần lớn các gRNA thể hiện các tế bào. Điều này có thể là do sự cao hơn của các biến thể virus cảng CRISPR/Cas9-gây đột biến vẫn còn cho phép các biểu hiện của protein chức năng. Để đánh giá này, các biến thể của virus bị cô lập từ hai nền văn hóa của các thể hiện CRISPR tế bào bị nhiễm tại cao MOI (0.5) và hiển thị sự cao hơn của virus sau 21 ngày kể từ ngày văn hóa (UL57 gRNA #1 UL70 gRNA #4). Tiếp theo 454 trình tự của các biến thể gen được nhắm mục tiêu chủ yếu được phát hiện nhất duy trì khung đọc chính xác của các gen cần thiết hai (hình 4) là chủ yếu là xóa số hoàn toàn codons (tức là 3-6-9-12 bp, vv) được phát hiện. Chúng tôi định lượng số với các biến thể của frameshift, và quan sát thấy một sự suy giảm rõ ràng này trong gRNA anti-HCMV thể hiện các tế bào được nhắm mục tiêu các gen cần thiết (1,3% UL57 # 1, và 4,6% về UL70 #4) so với gRNAs nhắm mục tiêu các gen không thiết yếu US7 và US11 (83,5 và 85,8% tương ứng) (hình 4A). Hơn nữa, sự phức tạp trình tự của các đột biến được chọn theo UL57 và UL70 nhắm mục tiêu thấp (hình 4B và 4 C), gợi ý lựa chọn trong số các phiên bản 'phù hợp' và sau đó mở rộng của những người đột biến truyền nhiễm theo thời gian. Để kết luận, CRISPR/Cas9-công nghệ đại diện cho một chiến lược đầy hứa hẹn để làm giảm HCMV rộng; Tuy nhiên, ứng dụng thành công của nó đòi hỏi phải thay đổi hiệu quả của bộ gen virus để tránh sự xuất hiện và sự lựa chọn của các biến thể thoát bypass CRISPR/Cas9 chỉnh sửa.

Kết quả (Việt) 2:

Nhắm mục tiêu hiệu quả của HCMV bởi gRNAs đơn chọn cho đột biến thoát virus sau khi nhân rộng kéo dài
nhiều nhiễm HCMV chống HCMV gRNAs khiếm hiệu quả duy nhất, ngăn chặn sao chép của virus và lan rộng lên tới 11 ngày sau nhiễm trùng (hình 3A). Tuy nhiên, virus sao chép cao có thẩm quyền nổi lên sau khi văn hóa kéo dài của các tế bào trong phần lớn các tế bào thể hiện gRNA. Điều này có thể là do sự phát triển tự nhiên của các biến thể virus chứa chấp CRISPR / đột biến Cas9 gây ra mà vẫn cho phép biểu hiện của protein chức năng. Để đánh giá này, các biến thể virus được phân lập từ hai nền văn hóa của các tế bào CRISPR-bày tỏ rằng đã bị nhiễm bệnh tại MOI cao (0,5) và hiển thị kết quả tự nhiên của virus sau 21 ngày nuôi cấy (UL57 gRNA # 1 và 4 UL70 gRNA #). Tiếp theo 454 trình tự của các gen mục tiêu chủ yếu phát hiện biến thể mà duy trì khung đọc chính xác của hai gen cần thiết (Hình 4) là chủ yếu là xóa bỏ các codon đầy đủ (tức là 3-6-9-12 bp, vv) đã được phát hiện. Chúng tôi định lượng số lượng các trình tự với các biến khung đọc, và quan sát thấy một sự suy giảm rõ ràng trong số này trong chống HCMV gRNA hiện các tế bào mục tiêu gen thiết yếu (1,3% cho UL57 # 1, và 4,6% trong 4 UL70 #) so để gRNAs nhắm mục tiêu các gen không cần thiết US7 và US11 (83,5 và 85,8% tương ứng) (Hình 4A). Hơn nữa, sự phức tạp chuỗi các đột biến được lựa chọn khi UL57 và UL70 nhắm mục tiêu đạt thấp (Hình 4B và 4C), gợi ý lựa chọn trong số ít các biến thể 'phù hợp' và mở rộng tiếp theo của những đột biến nhiễm theo thời gian. Để kết luận, các CRISPR / Cas9-công nghệ là một chiến lược đầy hứa hẹn để làm giảm HCMV nhân rộng; Tuy nhiên, ứng dụng thành công của nó đòi hỏi phải sửa đổi có hiệu lực của bộ gen của virus để tránh sự xuất hiện và lựa chọn các biến thể thoát mà bỏ qua CRISPR / Cas9 chỉnh sửa.