B. Determination of vitamin A in fo

B. Determination of vitamin A in foods by high-performance liquid
chromatography
I. References
Horwitz W and GW Latimer (Eds.). AOAC Official Method 2001.13.Vitamin A (Retinol) in
Foods.Vitamins and Other Nutrients.Chapter 45, p.53-56.Official Methods of Analysis of AOAC
International. 18thed, Revision 2, 2007. Maryland.
II. Principle
Standards and samples are saponified in basic ethanol-water solution, neutralized, and diluted. This
process converts fats to fatty acids, and retinyl esters to retinol and the corresponding fatty acids.
Extract clean-up is carried out with a C18 cartridge and vitamin A is concentrated eluting with a
smaller volume of isopropanol than the aliquot taken to clean. Retinol is quantified in an LC system,
using UV detection at 326 nm. Concentration is calculated by comparison of peak heights or peak
areas of retinol in test samples with those of standards.
Recovery of vitamin A in Infant Formula 1849 (NIST) was 99% as measured in the CPHL Laboratory.
III.Critical points and cautions
Due to the labile nature of retinol, it is important to saponify the samples under a nitrogen atmosphere
and in the presence of pyrogallic acid.
Potassium hydroxide is extremely caustic and it can cause severe burns. Protect skin and eyes while
performing this method. This method involves the use of flammable liquids. Perform behind a
barrier when using hot water, steam or an electric heating mantle. Use an effective fume removal
device to remove flammable vapors produced. Leave ample headroom in flask.
Protect samples from light by covering the glassware containing the sample extracts with aluminum
foil or a piece of black cloth, and work under subdue light.
IV. Equipment and materials
− HPLC system
Pump operating continuously at 1.0-2.0 mL/min with a flow precision of ± 1% or better
Injector. A manual injector or autosampling injector with a 100 μL fixed loop having a
typical sampling precision of ±0.25% or better
Reverse-phase C18 column, 5 μm (4.6x250 mm) capable of separating cis and trans isomers
of retinol with a resolution of 1.0 or greater.
Photometric detector monitoring absorbance at 326 nm.
Data collection system or integrator
− Sep-pak Cartridges C18 Vac 3cc (500 mg). Waters.or equivalent.
− Erlenmeyer flasks (125 mL) with neck adapted for connecting reflux condenser
− Hot plate
− Reflux condensers
- 27 -
− Volumetric flasks (100 and 10 mL)
− Nitrogen blanket apparatus8
V. Reagents
− Certified vitamin A acetate concentrate (USP) or
− Retinyl palmitate, all-trans.
− Acetic acid glacial, AR
− Acetonitrile, AR
− Isopropanol, AR
− Methanol, HPLC grade
− Absolute ethanol AR
− Tetrahydrofuran (THF), AR grade
− Hexane (n-Hexane 95% for HPLC)
− Pyrogallic acid, crystal, AR grade
VI.Solutions
a. Mobile phase: Combine 890 mL methanol and 110 mL distilled water. Mix well. Stir
overnight to degas or prior to use.
b. THF-methanol [50+50]: Combine 500 mL tetrahydrofuran and 500 mL 95% ethanol. Mix well.
c. Potassium hydroxide solution-50%: Slowly add 500 g of KOH pellets to 500 mL water
contained in a 2L thick walled Erlenmeyer flask. The solution gives off substantial heat while
KOH is dissolving. Add the KOH in 100 g portions while the flask is being cooled with cold water.
Swirl the flask gently to aid in dissolution of the KOH. Store in glass container with cork stopper.
d. Washing solution-acetonitrile-20% in water: Combine 80 mL water and 20 mLacetonitrile.
Mix well.
e. Vitamin A working standard (ca 5 µg retinol/mL)
1. Using USP standard: Weigh 50 mg retinyl acetate concentrate into a 100-mL volumetric
flask. Record weight to nearest 0.1 mg. Record concentration in mg/g per USP certification.
Add a small amount of acetone (less than 3 mL) to aid dissolution. Dilute to volume with
absolute ethanol. Store at 4°C in dark. Solution is stable for two weeks.
2. Using retinyl palmitate:
Stock solution: Weigh 55 mg retinyl palmitate into 100-mL volumetric flask. Record weight
to nearest 0.1 mg. Record purity per supplier certification or purity test. Add pea-sized piece of
pyrogallic acid. Dissolve and dilute to volume with hexane.
Working solution: Pipet 2 mL solution to second 100-mL flask and dilute to volume with
absolute ethanol. Store at 4°C in dark. Solution is stable for two weeks.
8 A supply of nitrogen gas with appropriate tubing and connectors to provide a constant nitrogen atmosphere blanket in the reflux apparatus during
saponification.
- 28 -
Check the concentration of retinyl palmitate stock solution every time is used. Pipette 2 mL
stock retinyl palmitate solution into a 100-mL volumetric flask and dilute to volume with hexane.
Read the absorbance at the maximum wavelength (325-328 nm) using a 1-cm pathlength cell
and hexane as blank. Calculate the purity of retinol palmitate for the working day as:
Where w = weight to prepare the stock retinyl palmitate in hexane in mg.
Purity of stock solution when a new standard is opened:
Check purity as follows: Dissolve 50 mg (record to nearest 0.1 mg) of retinyl palmitate standard
in 2-propanol (UV-spectroscopy grade) in a 500-mL flask and dilute to volume. Dilute 10 mL
of this solution to 100 mL with 2-propanol (final concentration is approximately 10 mg per
liter). Measure maximum absorbance obtained at 325-328 nm using a 1-cm pathlength cell and
2-propanol as blank. Calculate purity of retinol palmitate as
where Amax = absorbance maximum; (5x106
) = combined dilution factors, conversion to 1%
equivalent solution, and conversion to percent; 960= absorbance of pure retinyl palmitate (1%
solution in 1-cm cell), and w=weight of retinyl palmitate standard in mg

Kết quả (Việt) 1:

B. xác định của vitamin A trong thực phẩm bằng chất lỏng hiệu năng cao sắc kí I. tài liệu tham khảo Horwitz W và GW Latimer (chủ biên). AOAC phương pháp chính thức 2001.13.Vitamin một (Retinol) trong Foods.Vitamins và khác Nutrients.Chapter 45, p.53-56.Official phương pháp của phân tích của AOAC Quốc tế. 18thed, phiên bản 2, 2007. Maryland. II. nguyên tắc Tiêu chuẩn và các mẫu được saponified trong dung dịch nước ethanol cơ bản, vô hiệu hóa, và pha loãng. Điều này quá trình chuyển đổi chất béo để axit béo và retinyl Este retinol và các axit béo tương ứng. Chiết xuất sạch-up được thực hiện với một mực C18 và vitamin A là tập trung eluting với một nhỏ hơn khối lượng của isopropanol hơn aliquot thực hiện để làm sạch. Retinol định lượng trong một hệ thống LC, bằng cách sử dụng UV phát hiện tại 326 nm. Tập trung được tính bằng cách so sánh của đỉnh heights hoặc cao điểm khu vực của retinol trong mẫu thử nghiệm với tiêu chuẩn. Phục hồi của vitamin A trong năm 1849 công thức trẻ sơ sinh (NIST) là 99% tính tại Trung tâm CPHL. III. Điểm quan trọng và cẩn trọng Do bản chất labile của retinol, nó là quan trọng để saponify mẫu dưới một bầu không khí nitơ và sự hiện diện của pyrogallic acid. Kali hydroxit là cực kỳ ăn da và nó có thể gây bỏng nặng. Bảo vệ da và mắt trong khi thực hiện phương pháp này. Phương pháp này liên quan đến việc sử dụng các chất lỏng dễ cháy. Thực hiện đằng sau một rào cản khi sử dụng nước nóng, hơi nước hoặc một lớp phủ điện sưởi ấm. Sử dụng một loại bỏ hiệu quả khói thiết bị để loại bỏ hơi dễ cháy sản xuất. Để lại dư dật headroom trong flask. Bảo vệ mẫu từ ánh sáng bằng cách bao gồm thủy tinh có chứa chất chiết xuất từ mẫu với nhôm lá hoặc một mảnh vải màu đen, và các công việc dưới chinh phục ánh sáng. IV. thiết bị và vật liệu− HPLC hệ thống Bơm hoạt động liên tục tại 1,0-2,0 mL/phút với độ chính xác dòng chảy ± 1% hoặc tốt hơn Vòi phun. Một hướng dẫn sử dụng vòi phun hoặc autosampling vòi phun với một μL 100 cố định vòng lặp có một Lấy mẫu điển hình chính xác của ±0.25% hoặc tốt hơn Đảo ngược pha C18 cột, có khả năng tách đồng phân cis và trans 5 μm (4.6x250 mm) của retinol với độ phân giải 1.0 hoặc cao hơn. Thể phát hiện giám sát hấp thu tại 326 nm. Hệ thống thu thập dữ liệu hoặc tích hợp− Sep-pak hộp mực C18 Vac 3cc (500 mg). Waters.or tương đương.− Erlenmeyer bình (125 mL) với cổ phù hợp cho trào ngược ngưng kết nối− tấm nóng− trào ngược ngưng -27-− thể tích bình (100 và 10 mL)− Nitơ chăn apparatus8 V. thuốc thử− chứng nhận vitamin A axetat đậm đặc (USP) hoặc− Retinyl palmitat, tất cả-trans.− axit axetic băng giá, AR− Acetonitrile, AR− Isopropanol, AR− Methanol, HPLC lớp− Tuyệt đối ethanol AR− Tetrahydrofuran (THF), AR lớp− hexan (n-Hexane 95% cho hệ HPLC)− Pyrogallic axit, pha lê, AR lớp VI. Giải pháp a. di động giai đoạn: kết hợp 890 mL methanol và 110 mL nước chưng cất nước. Trộn đều. Khuấy qua đêm để degas hoặc trước khi sử dụng. sinh THF-methanol [50 + 50]: kết hợp 500 mL tetrahydrofuran và 500 mL 95% ethanol. Trộn đều. c. kali hydroxit giải pháp - 50%: chậm thêm 500 g KOH bánh 500 mL nước chứa trong một 2L dày có tường bao quanh Erlenmeyer flask. Các giải pháp cho giảm nhiệt đáng kể trong khi KOH hòa tan. Thêm KOH trong 100 g phần trong khi flask được làm mát bằng nước lạnh. Swirl flask nhẹ nhàng để hỗ trợ trong sự sụp đổ của KOH. Lưu trữ trong thùng chứa thủy tinh với cork stopper. mất rửa giải pháp-acetonitrile - 20% trong nước: kết hợp 80 mL nước và 20 mLacetonitrile. Trộn đều. e. Vitamin A làm việc tiêu chuẩn (ca 5 µg retinol/mL) 1. sử dụng USP chuẩn: cân nặng 50 mg retinyl axetat tập trung vào một 100-mL thể tích mới bình. Ghi lại trọng lượng để gần nhất cách 0.1 mg. Hồ sơ nồng độ trong mg/g một chứng nhận USP. Thêm một số lượng nhỏ axeton (ít hơn 3 mL) để hỗ trợ giải thể. Pha loãng để khối lượng với ethanol tuyệt đối. Lưu trữ ở 4° C trong bóng tối. Giải pháp là ổn định cho hai tuần. 2. sử dụng retinyl palmitat: Chứng khoán giải pháp: cân nhắc 55 mg retinyl palmitat thành 100 mL thể tích bình. Ghi lại trọng lượng gần nhất cách 0.1 mg. Hồ sơ tinh khiết / nhà cung cấp chứng nhận hoặc tinh khiết kiểm tra. Thêm kích cỡ hạt đậu mảnh pyrogallic axít. Hòa tan và pha loãng để khối lượng với hexan. Làm việc giải pháp: Pipet 2 mL giải pháp thứ hai 100 mL flask và pha loãng để khối lượng với ethanol tuyệt đối. Lưu trữ ở 4° C trong bóng tối. Giải pháp là ổn định cho hai tuần. 8 một nguồn cung cấp khí nitơ với ống thích hợp và kết nối để cung cấp một tấm chăn khí quyển liên tục nitơ trong bộ máy trào ngược trong saponification. -28- Kiểm tra nồng độ của retinyl palmitat cổ phần giải pháp mỗi khi được sử dụng. Pipette 2 mL chứng khoán retinyl palmitat giải pháp thành một flask thể tích 100 mL và pha loãng để khối lượng với hexan. Đọc hấp thu ở bước sóng tối đa (325-328 nm) bằng cách sử dụng một tế bào 1-cm pathlength và hexan là trống. Tính toán độ tinh khiết của retinol palmitat cho ngày làm việc như: Nơi w = trọng lượng để chuẩn bị palmitat cổ phiếu retinyl hexan trong mg. Độ tinh khiết của chứng khoán giải pháp khi một tiêu chuẩn mới được mở ra: Kiểm tra độ tinh khiết như sau: hòa tan 50 mg (ghi để gần nhất cách 0.1 mg) của retinyl palmitat tiêu chuẩn trong 2-propanol (lớp quang phổ UV) trong một flask 500 mL và loãng âm lượng. Pha loãng 10 mL của giải pháp này đến 100 mL với 2-propanol (cuối cùng tập trung là khoảng 10 mg mỗi lít). Biện pháp hấp thu tối đa đạt được bằng cách sử dụng một tế bào 1-cm pathlength 325-328 nm và 2-propanol là trống. Tính toán độ tinh khiết của retinol palmitat như nơi Amax = hấp thu tối đa; (5 x 106 ) = yếu tố kết hợp pha loãng, chuyển đổi để 1% giải pháp tương đương, và chuyển đổi sang phần trăm; 960 = hấp thu của retinyl tinh khiết palmitat (1% giải pháp trong 1-cm tế bào), và w = trọng lượng của retinyl palmitat tiêu chuẩn trong mg

Kết quả (Việt) 2:

B. Xác định vitamin A trong thực phẩm bởi hiệu suất cao lỏng
sắc ký
I. Tài liệu tham khảo
Horwitz W và GW Latimer (Eds.). AOAC Official Method 2001.13.Vitamin A (Retinol) trong
Foods.Vitamins và khác Nutrients.Chapter 45, Phương pháp p.53-56.Official phân tích của AOAC
International. 18thed, Revision 2, 2007. Maryland.
II. Nguyên tắc
tiêu chuẩn và mẫu được saponified trong dung dịch ethanol-nước cơ bản, trung hòa, và pha loãng. Điều này
quá trình chuyển đổi chất béo thành các acid béo, và este retinyl để retinol và các axit béo tương ứng.
Trích xuất sạch-up được thực hiện với một hộp mực C18 và vitamin A là tập trung giải hấp với một
khối lượng nhỏ hơn của isopropanol hơn số chia hết lấy để làm sạch. Retinol được định lượng trong một hệ thống LC,
sử dụng UV phát hiện ở 326 nm. Nồng độ được tính bằng cách so sánh chiều cao pic hoặc cao điểm
khu vực của retinol trong các mẫu thử nghiệm với những tiêu chuẩn.
Phục hồi của vitamin A trong Infant Formula 1849 (NIST) là 99% được đo trong phòng thí nghiệm CPHL.
Điểm III.Critical và cảnh báo
Do tính chất không ổn định của retinol, điều quan trọng là để làm hóa thành xà bông mẫu dưới một bầu không khí nitơ
và trong sự hiện diện của axit pyrogallic.
hydroxit kali là cực kỳ ăn da và nó có thể gây bỏng nặng. Bảo vệ da và mắt, trong khi
thực hiện phương pháp này. Phương pháp này liên quan đến việc sử dụng các chất lỏng dễ cháy. Thực hiện đằng sau một
rào cản khi sử dụng nước nóng, hơi nước hoặc một lớp vỏ điện sưởi ấm. Sử dụng một loại bỏ khói hiệu quả
thiết bị để loại bỏ hơi dễ cháy được sản xuất. Để lại nhiều khoảng không trong bình.
Bảo vệ mẫu từ ánh sáng bằng cách bao phủ thủy tinh có chứa các chất chiết xuất mẫu với nhôm
lá mỏng hoặc một miếng vải màu đen, và làm việc dưới ánh sáng khuất phục.
IV. Thiết bị và vật liệu
- Hệ thống HPLC
bơm hoạt động liên tục ở 1,0-2,0 mL / phút với độ chính xác dòng chảy của ± 1% hoặc tốt hơn
Injector. Một vòi phun bằng tay hoặc autosampling phun với 100 ml vòng lặp cố định có một
độ chính xác lấy mẫu điển hình của ± 0.25% hoặc cao hơn
khoản pha C18 cột, 5 mm (4.6x250 mm) có khả năng tách đồng phân cis và trans
của retinol với độ phân giải 1.0 hoặc lớn hơn.
Photometric dò giám sát độ hấp thụ ở 326 nm.
Dữ liệu hệ thống thu gom hoặc tích hợp
- Sep-Pak Cartridges C18 Vac 3cc (500 mg). Waters.or tương đương.
- Phích Erlenmeyer (125 mL) với cổ phù hợp để kết nối hồi lưu
- tấm Hot
- ngưng trào ngược
- 27 -
- Phích tích (100 và 10 mL)
- Nitơ chăn apparatus8
V. Thuốc thử
- Chứng vitamin A tập trung acetate (USP) hoặc
- Retinyl palmitate, tất cả-trans.
- Axit axetic băng, AR
- Acetonitrile, AR
- Rượu isopropanol, AR
- Methanol, HPLC lớp
- AR ethanol tuyệt đối
- Tetrahydrofuran (THF), AR lớp
- Hexane (n-Hexane 95% cho HPLC)
- Pyrogallic acid, tinh thể, AR lớp
VI.Solutions
a. Pha động: Kết hợp 890 ml methanol và 110 mL nước cất. Trộn đều. Khuấy
qua đêm để đuổi khí hoặc trước khi sử dụng.
B. THF-methanol [50 + 50]: Kết hợp 500 ml tetrahydrofuran và 500 ml ethanol 95%. Trộn đều.
C. Kali hydroxyd 50%: Từ từ thêm 500 g KOH viên đến 500 ml nước
chứa trong một dày vách bình Erlenmeyer 2L. Các giải pháp cho phép giảm nhiệt đáng kể trong khi
KOH được hòa tan. Thêm KOH trong 100 g phần trong khi bình được làm nguội bằng nước lạnh.
Swirl bình nhẹ nhàng để hỗ trợ trong giải thể KOH. Cửa hàng trong hộp thuỷ tinh có nút chai stopper.
D. Rửa giải pháp-acetonitrile-20% trong nước: Kết hợp 80 ml ​​nước và 20 mLacetonitrile.
Trộn đều.
E. Vitamin A tiêu chuẩn làm việc (ca 5 microgam retinol / mL)
1. Sử dụng tiêu chuẩn USP: Cân 50 mg retinyl acetate tập trung vào một 100-mL thể tích
bình. Ghi trọng lượng gần 0,1 mg. Nồng độ kỷ lục trong mg / g mỗi chứng nhận USP.
Thêm một lượng nhỏ acetone (ít hơn 3 mL) để hỗ trợ giải thể. Pha loãng tới vạch bằng
ethanol tuyệt đối. Bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C trong bóng tối. Giải pháp ổn định trong hai tuần.
2. Sử dụng retinyl palmitate:
giải pháp chứng khoán: Cân 55 mg retinyl palmitate vào 100 mL bình định mức. Ghi trọng lượng
tới gần 0,1 mg. Ghi tinh khiết mỗi cấp giấy chứng nhận nhà cung cấp hoặc kiểm tra độ tinh khiết. Thêm mảnh bằng hạt đậu của
axit pyrogallic. Hòa tan và pha loãng tới vạch bằng hexane.
Giải pháp làm việc: giải pháp Pipet 2 mL đến thứ hai bình 100 ml và pha loãng tới vạch bằng
ethanol tuyệt đối. Bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C trong bóng tối. Giải pháp ổn định trong hai tuần.
8 Một nguồn cung cấp khí nitơ với ống và đầu nối thích hợp để cung cấp một tấm chăn khí nitơ không đổi trong bộ máy trào ngược trong quá trình
xà phòng hóa.
- 28 -
Kiểm tra nồng độ của dung dịch retinyl palmitate mỗi khi được sử dụng. Pipette 2 mL
dung dịch retinyl palmitate vào 100 ml bình định mức và pha loãng tới vạch bằng hexane.
Đọc độ hấp thụ ở bước sóng tối đa (325-328 nm) bằng cách sử dụng một tế bào pathlength 1-cm
và hexane như trống. Tính độ tinh khiết của retinol palmitate cho ngày làm việc như:
Trường hợp w = trọng lượng để chuẩn bị palmitate cổ retinyl trong hexane trong mg.
Purity của dung dịch khi một tiêu chuẩn mới được mở ra:
Kiểm tra độ tinh khiết như sau: Hòa tan 50 mg (kỷ lục đến gần nhất 0,1 mg) của retinyl palmitate chuẩn
trong 2-propanol (UV-quang phổ học lớp) trong bình định mức 500 ml và pha loãng tới vạch. Pha loãng 10 ml
dung dịch này thành 100 ml với 2-propanol (nồng độ cuối cùng là khoảng 10 mg mỗi
lít). Đo độ hấp thụ tối đa thu được tại 325-328 nm sử dụng một tế bào pathlength 1-cm và
2-propanol như trống. Tính độ tinh khiết của retinol palmitate là
nơi Amax = độ hấp thụ tối đa; (5x106) = yếu tố pha loãng kết hợp, chuyển đổi tới 1% giải pháp tương đương, và chuyển đổi sang phần trăm; 960 = độ hấp thụ của retinyl palmitate tinh khiết (1% dung dịch trong tế bào 1-cm), và w = trọng lượng của tiêu chuẩn retinyl palmitate trong mg