What is SSCP?SSCP Analysis: Single-

What is SSCP?

SSCP Analysis: Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis

SSCP is the simplest and most used method of mutation detection. PCR is used to amplify the region of interest and the resultant DNA is separated as single-stranded molecules by electrophoresis in a non-denaturing polyacrylamide gel (Orita et al, 1989). A strand of single-stranded DNA folds differently from another if it differs by a single base, and it is believed that mutation-induced changes of tertiary structure of the DNA results in different mobilities for the two strands. These mutations are detected as the appearance of new bands on autoradiograms (radioactive detection), by silver staining of bands or the use of fluorescent PCR primers which are subsequently detected by an automated DNA sequencer (non-radioactive detection).

The tertiary structure of single stranded DNA changes under different physical conditions e.g. temperature and ionic environment. Hence the sensitivity of SSCP depends on these (and many other) conditions (see below). Whilst some empirical rules have emerged for the choice of separation conditions for sequence variants in particular sequence contexts, it is not possible to predict whether a certain mutation can be detected under given conditions, especially when the mutation is in a new sequence context. Mutation detection for PCR-SSCP is generally high, >80% in a single run for fragments shorter than 300bp (Hayashi and Yandell, 1993). As sensitivity is not 100%, the absence of a new band does not prove that there is no mutation in the analysed molecule.

The sensitivity of PCR-SSCP decreases with increasing fragment length, 300bp and whole cDNAs) overlapping short primer sets can be used, or long PCR products digested with appropriate restriction enzymes prior to SSCP (however, reamplification of individual new bands with the original primer set is now no longer possible).



Advantages

SSCP screening has two primary advantages as a mutation-screening technique:

You can screen for mutations in a specified DNA region by choosing PCR primers that span that region.
You can screen a large number of samples because the technique is simple and fast.
The only step necessary after PCR amplification is a heat denaturation in formamide and NaOH.



Limitations

SSCP screening only tells you that a mutation exists. You must perform subsequent DNA sequencing to determine the nature of the mutation that caused an electrophoretic mobility shift in a given sample.

Moreover, not all point mutations in a given sequence will cause a detectable change in electrophoretic mobility. However, by optimizing PCR reactions and run conditions before attempting a large-scale screening you can increase the sensitivity.

Variations and modifications of SSCP:

Multiple gel running conditions
temperature (~ room temperature, ~ 4oC)
addition of additives e.g. glycerol (5-10%); sucrose (10%)
Different gel matrices
Low polyacrylamide cross linker ratios (49:1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gels)
MDE, GeneAmp, Hydrolink gels
Agarose gels (resolution of minisatellite isoalleles (same length , but a few base pair substitutions within the minisatellite repeat) as long as 6.3kb; Monkton and Jeffreys, 1995).
High throughput SSCP: use of sharkstooth combs, multichannel pipettes, microtitre plates, staggered repetitive loadings on two gels poured between three plates resulted in 1000 PCR reactions prepared and analysed in 24 man hours using five 40cm x 30cm gel tanks. Used for the analysis of exon 3 of the LDLR in patients with familial hypercholesterolaemia (Whittall et al, 1995).
rSSCP: RNA-SSCP: single stranded RNA should have a larger repertoire of secondary structure, since RNA basepairing is more stable than RNA-DNA basepairing, and might be expected to adopt more conformational structure and hence be more sensitive to sequence changes. Efficiency of detection: 70% for rSSCP in comparison to 35% for SSCP (for 2.6kb of Factor IX gene). However, it is more inconvenient to make RNA strands (involving introducing RNA polymerase promoters etc.) and although the abundance of transcript allows for ethidium bromide detection of the rSSCPs, the added complexity and expense has precluded widespread use (Sarkar et al, 1992a).
REF-SSCP: Restriction endonuclease fingerprinting. A modification of SSCP where a 1-kb segment is digested with 5 restriction enzymes designed to produce fragments of ~150bp (Factor IX gene). After digestion the products are mixed, end-labelled with 32P, denatured and electrophoresed under non-denaturing conditions. Two 'components' are evident; the gain or loss of restriction site 'informative restriction component' or abnormal mobility of the 5 restriction fragments (10 strands) called the 'SSCP component'. Efficiency of detection: 96% detection (5.6%polyacrylamide/23oC) or 100% (7.5%GeneAmp/23oC or 8oC) of 24 test mutations (Liu and Sommer, 1995).

Kết quả (Việt) 1:

SSCP là gì?SSCP phân tích: Đơn lõi Conformation đa hình phân tíchSSCP là đơn giản nhất và hầu hết sử dụng các phương pháp phát hiện đột biến. Đảng Cộng sản Romania được sử dụng để khuyếch đại vùng ưa thích và kết quả DNA tách ra thành phân tử đơn-stranded bởi điện trong một phòng không biến tính polyacrylamide gel (Orita và ctv., 1989). Một chuỗi đơn-stranded DNA nếp gấp một cách khác nhau từ khác nếu nó khác với bởi một cơ sở duy nhất, và người ta tin rằng đột biến gây ra những thay đổi của đại học cấu trúc của DNA kết quả trong mobilities khác nhau cho hai sợi. Những đột biến được phát hiện như sự xuất hiện của các ban nhạc mới trên autoradiograms (phát hiện phóng xạ), bởi bạc nhuộm của ban nhạc hoặc sử dụng lớp lót PCR huỳnh quang mà sau đó được phát hiện bởi một tự động DNA sequencer (phòng không phóng xạ phát hiện).Cấu trúc đại học duy nhất đang bị kẹt lại ADN thay đổi dưới điều kiện vật lý khác nhau ví dụ như nhiệt độ và ion môi trường. Do đó sự nhạy cảm của SSCP phụ thuộc vào đây (và nhiều khác) điều kiện (xem bên dưới). Trong khi một số quy tắc thực nghiệm đã nổi lên cho sự lựa chọn của ly thân điều kiện cho chuỗi Phiên bản đặc biệt bối cảnh trình tự, nó là không thể dự đoán liệu một đột biến nào đó có thể được phát hiện theo cho điều kiện, đặc biệt là khi các đột biến là trong một bối cảnh trình tự mới. Đột biến phát hiện cho Đảng Cộng sản Romania-SSCP là nói chung cao, > 80% trong một đơn chạy cho đoạn ngắn hơn 300bp (Hayashi và Yandell, 1993). Là nhạy cảm không phải là 100%, sự vắng mặt của một ban nhạc mới không chứng minh là không có đột biến trong phân tử phân tích.The sensitivity of PCR-SSCP decreases with increasing fragment length, <300bp being the optimum. For mutation detection in longer fragments (exons >300bp and whole cDNAs) overlapping short primer sets can be used, or long PCR products digested with appropriate restriction enzymes prior to SSCP (however, reamplification of individual new bands with the original primer set is now no longer possible). AdvantagesSSCP screening has two primary advantages as a mutation-screening technique:You can screen for mutations in a specified DNA region by choosing PCR primers that span that region.You can screen a large number of samples because the technique is simple and fast.The only step necessary after PCR amplification is a heat denaturation in formamide and NaOH. LimitationsSSCP screening only tells you that a mutation exists. You must perform subsequent DNA sequencing to determine the nature of the mutation that caused an electrophoretic mobility shift in a given sample.Moreover, not all point mutations in a given sequence will cause a detectable change in electrophoretic mobility. However, by optimizing PCR reactions and run conditions before attempting a large-scale screening you can increase the sensitivity.Variations and modifications of SSCP:Multiple gel running conditionstemperature (~ room temperature, ~ 4oC)addition of additives e.g. glycerol (5-10%); sucrose (10%)Different gel matricesLow polyacrylamide cross linker ratios (49:1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gels)MDE, GeneAmp, Hydrolink gelsAgarose gels (resolution of minisatellite isoalleles (same length , but a few base pair substitutions within the minisatellite repeat) as long as 6.3kb; Monkton and Jeffreys, 1995).High throughput SSCP: use of sharkstooth combs, multichannel pipettes, microtitre plates, staggered repetitive loadings on two gels poured between three plates resulted in 1000 PCR reactions prepared and analysed in 24 man hours using five 40cm x 30cm gel tanks. Used for the analysis of exon 3 of the LDLR in patients with familial hypercholesterolaemia (Whittall et al, 1995).rSSCP: RNA-SSCP: single stranded RNA should have a larger repertoire of secondary structure, since RNA basepairing is more stable than RNA-DNA basepairing, and might be expected to adopt more conformational structure and hence be more sensitive to sequence changes. Efficiency of detection: 70% for rSSCP in comparison to 35% for SSCP (for 2.6kb of Factor IX gene). However, it is more inconvenient to make RNA strands (involving introducing RNA polymerase promoters etc.) and although the abundance of transcript allows for ethidium bromide detection of the rSSCPs, the added complexity and expense has precluded widespread use (Sarkar et al, 1992a).REF-SSCP: Restriction endonuclease fingerprinting. A modification of SSCP where a 1-kb segment is digested with 5 restriction enzymes designed to produce fragments of ~150bp (Factor IX gene). After digestion the products are mixed, end-labelled with 32P, denatured and electrophoresed under non-denaturing conditions. Two 'components' are evident; the gain or loss of restriction site 'informative restriction component' or abnormal mobility of the 5 restriction fragments (10 strands) called the 'SSCP component'. Efficiency of detection: 96% detection (5.6%polyacrylamide/23oC) or 100% (7.5%GeneAmp/23oC or 8oC) of 24 test mutations (Liu and Sommer, 1995).

Kết quả (Việt) 2:

? SSCP là gì SSCP Phân tích: Single-Strand cấu Polymorphism Phân tích SSCP là phương pháp đơn giản nhất và được sử dụng hầu hết các phát hiện đột biến. PCR được dùng để khuếch đại các vùng quan tâm và kết quả DNA được tách như các phân tử sợi đơn bằng điện trong một polyacrylamide gel không biến tính (Orita et al, 1989). Một sợi DNA sợi đơn nếp gấp khác nhau từ khác nếu nó khác nhau bởi một cơ sở duy nhất, và người ta tin rằng những thay đổi đột biến gây ra các cấu trúc đại học của các kết quả DNA trong độ linh động khác nhau cho hai mạch. Những đột biến này được phát hiện như là sự xuất hiện của các ban nhạc mới trên autoradiograms (phát hiện phóng xạ), bằng cách nhuộm bạc của các ban nhạc hoặc sử dụng các mồi PCR huỳnh quang mà sau đó được phát hiện bởi một chuỗi DNA tự động (phát hiện không phóng xạ). Các cấu trúc bậc ba của đơn thay đổi DNA bị mắc kẹt dưới các điều kiện vật lý khác nhau ví dụ như nhiệt độ và môi trường ion. Do đó độ nhạy của SSCP phụ thuộc vào những điều này (và nhiều người khác) (xem bên dưới). Trong khi một số quy tắc thực nghiệm đã xuất hiện cho sự lựa chọn của điều kiện tách cho chuỗi các biến thể trong bối cảnh trình tự cụ thể, nó không phải là có thể dự đoán liệu một đột biến nhất định có thể được phát hiện trong những điều kiện nhất định, đặc biệt là khi các đột biến là trong bối cảnh một chuỗi mới. Phát hiện đột biến cho PCR-SSCP nói chung là cao,> 80% trong một hoạt động duy nhất cho mảnh ngắn hơn 300bp (Hayashi và Yandell, 1993). Như độ nhạy cảm không phải là 100%, sự vắng mặt của một ban nhạc mới này không chứng minh rằng không có đột biến trong phân tử phân tích. Độ nhạy của PCR-SSCP giảm khi tăng chiều dài mảnh, <300bp là tối ưu. Để phát hiện đột biến trong còn mảnh (exon> 300bp và toàn bộ các cDNA) chồng chéo cặp mồi ngắn có thể được sử dụng, hoặc các sản phẩm PCR dài tiêu hóa bằng cách hạn chế thích hợp enzym trước khi SSCP (tuy nhiên, reamplification của các ban nhạc mới với các thiết lập cá nhân mồi đầu là bây giờ không có . còn có thể) Ưu điểm sàng lọc SSCP có hai ưu điểm chính là một kỹ thuật đột biến sàng lọc: Bạn có thể sàng lọc các đột biến ở một vùng DNA quy định bằng cách chọn mồi PCR mà span rằng khu vực này. Bạn có thể sàng lọc một số lượng lớn các mẫu vì kỹ thuật này khá đơn giản và nhanh chóng. Các bước chỉ cần thiết sau khi khuếch đại PCR là một biến tính nhiệt trong Formamid và NaOH. Hạn chế SSCP sàng chỉ cho bạn biết rằng một đột biến tồn tại. Bạn phải thực hiện trình tự DNA tiếp theo để xác định bản chất của đột biến gây ra một sự thay đổi tính di động điện di trong một mẫu nhất định. Hơn nữa, không phải tất cả các đột biến điểm trong một trình tự nhất định sẽ gây ra một sự thay đổi được phát hiện ở tính di động điện di. Tuy nhiên, bằng cách tối ưu phản ứng PCR và điều kiện chạy trước khi thử một quy mô lớn lọc bạn có thể tăng độ nhạy. Variations và sửa đổi của SSCP: Nhiều gel điều kiện chạy nhiệt độ (nhiệt độ phòng ~, ~ 4oC) thêm các phụ gia như glycerol (5-10 %); sucrose (10%) các ma trận gel khác nhau tỷ lệ chéo linker polyacrylamide thấp (49: 1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gel) MDE, GeneAmp, HYDROLINK gel gel agarose (độ phân giải của isoalleles minisatellite (chiều dài tương tự, nhưng một vài thay thế cặp base trong lặp lại minisatellite) miễn là 6.3kb; Monkton và Jeffreys, 1995). thông cao SSCP: sử dụng lược sharkstooth, pipet đa kênh, tấm vi, loạng choạng tải trọng lặp đi lặp lại trên hai gel đổ giữa ba tấm dẫn vào năm 1000 PCR phản ứng chuẩn bị và phân tích trong 24 giờ người đàn ông sử dụng năm 40cm x 30cm thùng gel. Được sử dụng để phân tích các exon 3 của chuột Ldlr ở bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính gia đình (Whittall et al, 1995). rSSCP: RNA-SSCP: RNA duy nhất nên có một tiết mục lớn của cấu trúc thứ cấp, kể từ RNA basepairing là ổn định hơn RNA- basepairing DNA, và có thể được dự kiến sẽ thông qua cấu trúc cấu hình không nhiều và do đó thể nhạy cảm hơn với những thay đổi liên tục. Hiệu quả của việc phát hiện: 70% cho rSSCP so với 35% cho SSCP (cho 2.6kb của gen yếu tố IX). Tuy nhiên, nó là bất tiện hơn để làm cho sợi RNA (liên quan đến việc giới thiệu quảng bá RNA polymerase vv) và mặc dù sự phong phú của các bảng điểm cho phép phát hiện ethidium bromide của rSSCPs, mức độ phức tạp và chi phí thêm đã ngăn cản sử dụng rộng rãi (Sarkar et al, 1992a) . REF-SSCP: Restriction endonuclease fingerprinting. Một sự thay đổi của SSCP nơi một phân đoạn 1-kb được tiêu hóa với 5 enzim giới hạn được thiết kế để sản xuất mảnh vỡ của ~ 150bp (Yếu tố gen IX). Sau khi tiêu hóa các sản phẩm được trộn lẫn, cuối cùng dán nhãn với 32P, đã biến tính và electrophoresed trong điều kiện không biến tính. Hai 'thành phần' là hiển nhiên; các khoản lãi hoặc lỗ của trang web hạn chế 'hạn chế thành phần thông tin' hoặc di chuyển bất thường của các mảnh vỡ giới hạn 5 (10 sợi) gọi là 'SSCP thành phần'. Hiệu quả của việc phát hiện: phát hiện 96% (5,6% polyacrylamide / 23oC) hoặc 100% (7,5% GeneAmp / 23oC hoặc 8oC) của 24 thử nghiệm đột biến (Liu và Sommer, 1995).