The PDC from Gram-negative Azotobac

The PDC from Gram-negative Azotobacter vinelandii is well
characterized (18). The isolated E2p core consists of 24 subunits,which, unlike complexes from other organisms, dissociates into
smaller oligomers upon binding of Elp or E3 or both (19).
Attempts to cryst* the entire A. vinelandii E2p molecule failed
to produce crystals suitable for high-resolution difiaction studies,
probably because of the high flexibility of the lipoyl domains. However,
the cloning and overexpression of the catalyuc domain of A.
vinelandii E2p allowed the growth of good-quality crystals (20) that
enabled us to elucidate the atomic structure of the core of the complex,
which has the rather uncommon octahedral 432 symmetry.
Structure determination. The E2p catalytic domain (E2pCD)
was expressed as a fusion protein that contained: (i) the catalyuc
domain (residues 409 to 638 of A. vinelandii E2p); (ii) the Ala-Prorich
sequence (residues 382 to 408), which connects this part of the
structure to the Elp-E3 binding domain; and (iii) six amino acids
from P-galactosidase at the NH2-terminus (20). A multiple isomorphous
replacement map including anomalous data (MIRAS) with
an average figure of merit of 0.74 (Table 1) was calculated which
allowed an unambiguous tracing of most of the polypeptide chain
(Fig. 2). A model was built by using the fragment search option of
the program 0 (21), and the initial structure was improved by
crystallographic refinement with the energy minimization option of
the program X-PLOR (22) and by manual model rebuilding. The
current model contains highly restrained individual temperature
factors and coordinates for 2182 protein atoms and 37 water
molecules. The crystallographic R factor is 0.188 for 10,336 independent
reflections between 10.0 A and 2.6 A resolution. The
root-mean-square (rms) deviations from the ideal values for bonds
and angles are 0.017 A and 3.3", respectively. All backbone dihedral
angles (+, @ pairs) fall within the allowed regions, except for ~lal~~,
for which the + angle is 10" outside an allowed region.
The first 19 residues are not visible in the electron density map
probably because they are disordered. The first 6 amino acids belong
to the fusion sequence, whereas the next 13 belong to the Ala-Prorich
sequence at the NH2-terminus of E2pCD, thereby confirming
the high level of flexibility of this part of the molecule. Since the
amino acids of p-galactosidase present at the NH,-terminus of the
fusion protein are not visible in the electron density map, we use the
residue numbering of A. vinelandii E2p to describe the structure.
The tight association of the trimer. Each subunit of E2pCD
consists of a mixed p sheet composed of three central parallel strands
(strands E, G, and I) and three antiparallel ones (strands F, J, and B)
at its borders. Moreover, a threefold-related subunit provides a
seventh additional strand (strand H), that is adjacent and antiparallel
to strand B. This large P sheet is flanked on one side by helix Hl and
on the other by the remaining four (Y helices to generate a kind of
open face sandwich structure (Fig. 3A). In total the individual
subunit contains five (Y helices, one 3,,-helk (H6), and ten
strands, which comprise 64 percent of the total number of residues.

Kết quả (Việt) 1:

PDC từ Azotobacter Gram âm vinelandii là tốtđặc trưng (18). Lõi E2p bị cô lập bao gồm 24 subunits, trong đó, không giống như các tổ hợp từ các sinh vật khác, dissociates vàooligomers nhỏ hơn khi ràng buộc Elp E3 hoặc cả hai (19).Các nỗ lực để cứu * vinelandii A. toàn bộ phân tử E2p thất bạiđể sản xuất tinh thể phù hợp với độ phân giải cao difiaction nghiên cứu,có lẽ bởi vì tính linh hoạt cao trong các lĩnh vực lipoyl. Tuy nhiên,nhân bản vô tính và tế miền catalyuc của A.vinelandii E2p cho phép sự phát triển của tinh thể chất lượng tốt (20) màcho phép chúng tôi để làm sáng tỏ cấu trúc nguyên tử của cốt lõi của khu phức hợp,trong đó có sự đối xứng 432 Bát diện khá phổ biến.Xác định cấu trúc. Tên miền E2p chất xúc tác (E2pCD)được thể hiện như là một phản ứng tổng hợp protein chứa: (i) catalyuctên miền (dư lượng 409 để 638 của A. vinelandii E2p;) (ii Ala)-Prorichtrình tự (dư lượng 382-408), kết nối phần này của cáccấu trúc tên miền ràng buộc Elp-E3; và (iii) sáu amino axittừ P-hoá tại NH2-terminus (20). Nhiều isomorphousthay thế bản đồ bao gồm dữ liệu bất thường (MIRAS) vớimột con số trung bình của các bằng khen của 0,74 (bảng 1) đã được tính toán màcho phép một truy tìm rõ ràng của hầu hết các chuỗi polypeptide(Hình 2). Một mô hình được xây dựng bằng cách sử dụng tùy chọn tìm kiếm mảnhchương 0 (21), và các cấu trúc ban đầu được cải thiệncrystallographic tinh tế với các tùy chọn giảm thiểu năng lượngchương trình X-PLOR (22) và hướng dẫn sử dụng mô hình xây dựng lại. CácMô hình hiện tại có rất hạn chế nhiệt độ cá nhânCác yếu tố và tọa độ 2182 đạm nguyên tử và 37 nướcphân tử. Các yếu tố R crystallographic là 0.188 cho 10,336 độc lậpphản xạ giữa 10,0 A và 2,6 A độ phân giải. Cácgốc có nghĩa là hình vuông (rms) độ lệch từ các giá trị lý tưởng cho trái phiếuvà góc 0.017 A và 3.3", tương ứng. Tất cả các tiết diện nhị diện xương sốnggóc (+, @ cặp) nằm trong khu vực được phép, ngoại trừ cho ~ lal ~ ~,mà các + góc là 10" bên ngoài một khu vực được cho phép.Lần đầu tiên 19 dư lượng là không thể nhìn thấy trong bản đồ mật độ electroncó lẽ vì họ không trật tự. Các axit amin 6 đầu tiên thuộc vềđến chuỗi phản ứng tổng hợp, trong khi 13 tiếp theo thuộc về Ala Prorichtrình tự tại NH2 terminus của E2pCD, do đó xác nhậnmức độ cao của sự linh hoạt của phần này của các phân tử. Kể từ khi cácaxit amin của p-hoá hiện nay tại NH,-ga cuối của cácphản ứng tổng hợp protein không được nhìn thấy trong bản đồ mật độ electron, chúng tôi sử dụng cácdư lượng cách đánh số của A. vinelandii E2p để mô tả cấu trúc.Hiệp hội trimer chặt chẽ. Mỗi tiểu đơn vị của E2pCDbao gồm một tờ p hỗn hợp gồm ba sợi Trung song song(sợi E, G và I) và antiparallel ba cái (sợi F, J và B)tại biên giới của mình. Hơn nữa, một tiểu đơn vị liên quan Tam cung cấp mộtThứ bảy thêm sợi (sợi H), liền kề và traođể strand B. Tờ P lớn này hai bên một bên bằng cách xoắn Hl vàmặt khác bởi còn lại bốn (Y helices để tạo ra một loại củamở mặt bánh sandwich cấu trúc (hình 3A). Trong tổng số các cá nhântiểu đơn vị chứa 5 (Y helices, một 3,,-helk (H6), và mườisợi, 64 phần trăm của tổng số dư lượng bao gồm.

Kết quả (Việt) 2:

PDC từ Azotobacter vinelandii Gram âm cũng được
đặc trưng (18). Các E2p lõi cô lập bao gồm 24 tiểu đơn vị, trong đó, không giống như khu phức hợp từ các sinh vật khác, phân ly thành
oligome nhỏ khi ràng buộc của Elp hoặc E3 hoặc cả hai (19).
Những nỗ lực để Cryst * toàn bộ A. vinelandii E2p phân tử không
để sản xuất các tinh thể thích hợp cho nghiên cứu difiaction độ phân giải cao,
có thể là do sự linh hoạt cao trong các lĩnh vực lipoyl. Tuy nhiên,
các nhân bản và biểu hiện quá mức của miền catalyuc của A.
vinelandii E2p cho phép sự phát triển của các tinh thể chất lượng tốt (20) mà
cho phép chúng tôi làm sáng tỏ cấu trúc nguyên tử của lõi của khu phức hợp,
trong đó có khá phổ biến bát diện 432 đối xứng.
quyết định cơ cấu. Các E2p xúc tác miền (E2pCD)
được thể hiện như là một loại protein phản ứng tổng hợp có chứa: (i) catalyuc
miền (dư lượng 409-638 của A. vinelandii E2p); (ii) các Ala-Prorich
chuỗi (dư lượng 382-408), mà kết nối này là một phần của
cấu trúc cho miền Elp-E3 ràng buộc; và (iii) sáu axit amin
từ P-galactosidase ở NH2-ga cuối (20). Một đồng hình nhiều
đồ thay thế bao gồm cả dữ liệu bất thường (MIRAS) với
một con số trung bình khen của 0,74 (Bảng 1) được tính toán mà
cho phép một truy tìm rõ ràng của hầu hết các chuỗi polypeptide
(Hình. 2). Một mô hình được xây dựng bằng cách sử dụng các tùy chọn tìm kiếm mảnh vỡ của
các chương trình 0 (21), và các cấu trúc ban đầu đã được cải thiện bằng cách
tinh tinh với các tùy chọn năng lượng giảm thiểu các
chương trình X-PLOR (22) và bằng tay mô hình xây dựng lại. Các
mô hình hiện tại chứa nhiệt độ cá nhân rất hạn chế
các yếu tố và điều phối cho 2182 nguyên tử protein và 37 nước
phân tử. Các yếu tố R tinh là 0,188 cho 10.336 độc lập
phản xạ giữa 10,0 A và 2,6 Một nghị quyết. Các
root-mean-square (rms) chênh lệch từ giá trị lý tưởng đối với trái phiếu
và góc độ là 0,017 A và 3.3 ", tương ứng. Tất cả các nhị diện xương sống
góc (+, @ cặp) nằm trong khu vực được cho phép, trừ ~ lal ~~,
mà góc + là 10 "bên ngoài một khu vực cho phép.
19 dư lượng đầu tiên là không hiển thị trong bản đồ mật độ điện tử
có thể là vì họ bị rối loạn. 6 axit amin đầu tiên thuộc về
trình tự hợp nhất, trong khi đó tiếp theo 13 thuộc về Ala-Prorich
tự tại NH2-ga cuối của E2pCD, qua đó khẳng định
mức độ cao của tính linh hoạt của phần này của phân tử. Kể từ khi các
axit amin của p-galactosidase có mặt tại NH, -terminus của
protein phản ứng tổng hợp là không thể nhìn thấy trong các bản đồ mật độ điện tử, chúng tôi sử dụng
số dư lượng của A. vinelandii E2p để mô tả cấu trúc.
Các hiệp hội chặt chẽ của các trimer. Mỗi tiểu đơn vị của E2pCD
bao gồm một tấm p hỗn hợp gồm ba sợi trung tâm song song
(sợi E, G và I) và ba người phản song song (sợi F, J, và B)
tại biên giới của mình. Hơn nữa, một tiểu đơn vị gấp ba liên quan đến cung cấp một
sợi thêm thứ bảy (sợi H), mà là liền kề và phản song song
với sợi B. tấm P lớn này là hai bên trên một mặt bằng xoắn HL và
mặt khác bởi bốn (xoắn Y còn lại tạo ra một loại
mở cấu trúc khuôn mặt bánh sandwich (hình 3A). trong tổng số cá nhân.
tiểu đơn vị có năm (Y xoắn, một trong 3 ,, - helk (H6), và mười
sợi, trong đó bao gồm 64 phần trăm của tổng số dư.