CRISPR/Cas9 targeting of essential

CRISPR/Cas9 targeting of essential HSV-1 protein-encoding genes impairs virus replication
Since CRISPR/Cas9 proved efficient in limiting productive infection of the slowly replicating HCMV virus, we next assessed whether also the fast replicating alphaherpesvirus HSV-1 can be inhibited using this approach. We designed four gRNAs/gene targeting twelve essential HSV-1 genes [44]: the terminase UL15, the glycoprotein B coding UL27, the major binding protein UL29, the DNA polymerase UL30, the tegument protein UL36, the capsid assembly protein UL37, the DNA polymerase processivity factor UL42, the DNA replication protein UL5, the DNA helicase/primase complex protein UL52 and associated protein UL8, the transcriptional regulation protein UL54, and the replication origin binding protein UL9. We included gRNAs targeting the nonessential protein kinase US3 and the surface membrane protein US8. These anti-HSV-1 gRNAs were introduced into Vero cells. Subsequently, the cells were infected with HSV-1-eGFP, and monitored for eGFP expression as a measure for HSV-1 infection after 2 days. High percentages of infected cells were detected in untransduced cells and in cells transduced with empty vector or with vectors carrying gRNAs directed against cellular genes (Fig 5A). Most gRNAs targeting essential HSV-1 genes impaired virus replication effectively. In contrast to our observations for HCMV, targeting of nonessential HSV-1 genes (US3 and US8) also reduced HSV-1 replication, albeit to a lesser extent as compared to targeting essential genes.

Kết quả (Việt) 1:

CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu cần thiết HSV-1 gen mã hóa protein làm suy yếu nhân rộng vi rútKể từ khi CRISPR/Cas9 đã chứng minh hiệu quả trong hạn chế sản xuất nhiễm virus HCMV từ từ nhân bản, chúng tôi tiếp theo đánh giá cho dù cũng alphaherpesvirus nhân bản nhanh HSV-1 có thể ức chế bằng cách sử dụng cách tiếp cận này. Chúng tôi thiết kế bốn gRNAs/gen nhắm mục tiêu theo mười hai thiết yếu HSV-1 gen [44]: terminase UL15, glycoprotein B mã hóa UL27, protein ràng buộc chính UL29, DNA polymerase UL30, tegument protein UL36, capsid lắp ráp protein UL37, là yếu tố DNA polymerase processivity UL42, DNA nhân rộng protein UL5, DNA helicase/primase phức hợp protein UL52 và liên kết protein UL8, các protein transcriptional quy định UL54 , và sao chép nguồn gốc ràng buộc protein UL9. Chúng tôi bao gồm gRNAs nhắm mục tiêu không thiết yếu protein kinase US3 và các protein trên bề mặt màng US8. Các gRNAs anti-HSV-1 đã được giới thiệu vào các tế bào Vero. Sau đó, các tế bào bị nhiễm HSV-1-eGFP, và theo dõi cho các biểu hiện eGFP như là một biện pháp cho nhiễm HSV-1 sau 2 ngày. Tỷ lệ phần trăm cao của các tế bào bị nhiễm bệnh được phát hiện ở untransduced các tế bào và tế bào transduced với vector trống hoặc với vectơ mang gRNAs nhằm chống lại tế bào gen (hình 5A). Hầu hết các gRNAs mục tiêu cần thiết HSV-1 gen khiếm thị nhân rộng vi rút có hiệu quả. Ngược lại với những quan sát của chúng tôi cho HCMV, nhắm mục tiêu các gen HSV-1 không thiết yếu (US3 và US8) cũng giảm nhân bản HSV-1, mặc dù đến một mức độ thấp hơn so với nhắm mục tiêu các gen cần thiết.

Kết quả (Việt) 2:

CRISPR / Cas9 nhắm mục tiêu của HSV-1 gen protein mã hóa thiết yếu làm suy yếu sao chép của virus
Kể từ CRISPR / Cas9 chứng minh hiệu quả trong việc hạn chế lây nhiễm hiệu quả của virus HCMV chậm tái tạo, chúng ta tiếp theo đánh giá xem còn sao chép nhanh alphaherpesvirus HSV-1 có thể bị ức chế sử dụng này tiếp cận. Chúng tôi thiết kế bốn gRNAs / nhắm mục tiêu gen mười hai gen thiết yếu HSV-1 [44]: các terminase UL15, glycoprotein B mã hóa UL27, protein ràng buộc lớn UL29, DNA polymerase UL30, protein vỏ UL36, protein lắp ráp capsid UL37, các DNA polymerase yếu tố processivity UL42, protein sao chép DNA UL5, DNA helicase / primase protein phức tạp UL52 và protein liên UL8, các phiên mã protein quy định UL54, và sao chép có nguồn gốc gắn với protein UL9. Chúng tôi bao gồm gRNAs nhắm mục tiêu các US3 protein kinase không cần thiết và các US8 protein màng tế bào bề mặt. Những chống HSV-1 gRNAs đã được giới thiệu vào các tế bào Vero. Sau đó, các tế bào bị nhiễm HSV-1-EGFP, và theo dõi biểu hiện EGFP như một biện pháp để lây nhiễm HSV-1 sau 2 ngày. Tỷ lệ phần trăm cao của các tế bào bị nhiễm được phát hiện trong các tế bào untransduced và trong các tế bào tải nạp với vector rỗng hoặc với vectơ mang gRNAs chống lại gen của tế bào (Hình 5A). Hầu hết gRNAs nhắm mục tiêu thiết yếu gen HSV-1 khiếm sao chép của virus hiệu quả. Ngược lại với quan sát của chúng tôi cho HCMV, nhắm mục tiêu của không thiết yếu gen HSV-1 (US3 và US8) cũng giảm HSV-1 nhân rộng, mặc dù ở một mức độ thấp hơn so với mục tiêu gen thiết yếu.