The pooled active fractions from th

The pooled active fractions from the phosphocellulose step were dialyzed twice against 1 liter of Buffer A at 25° C. and applied to an 250×10 mm SynChropak AX-300 anion exchange HPLC column pre-equilibrated in Buffer A (Rainin Corp., Emeryville, Calif.) at a flow rate of 2.4 ml/minute. Samples were in Buffer A. Bound proteins were eluted with a fifty ml linear gradient from 100 mM to 700 mM NaCl in Buffer A at 2.4 ml/minute. Bst DNA polymerase activity eluted at an ionic strength corresponding to a salt concentration of between about 0.2 and 0.4 M NaCl.

In some cases, the purified full-length Bst polymerase was further treated with a protease to generate an active truncated form of the enzyme. In such cases, purified Bst polymerase (0.33 mg/ml) was treated with subtilisin in Buffer A at a 1:200 (w/w) ratio of protease to Bst polymerase at 25° C. The reaction mixture was incubated at 25° C. for 40 minutes, and the reaction was terminated with the addition of PMSF to a final concentration of 1 mM. The active proteolytic fragment of Bst DNA polymerase was purified using a 60×10 mm column of hydroxyapatite (HA) (Bio Gel-HT, BioRad Laboratories, Richmond, Calif.) according to the method of Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623 (1974) the disclosure of which is hereby incorporated by reference herein. The HA column was equilibrated in 20 mM sodium phosphate (pH 7.0), and Bst polymerase was eluted with a linear gradient from 20 to 350 mM sodium phosphate (pH 7.0) at a flow rate of 1 ml/minute. The active protein eluted at an ionic strength corresponding to about 0.3 M sodium phosphate. The active fractions were pooled.

Kết quả (Việt) 1:

Các phần phân đoạn của hoạt động tới từ bước phosphocellulose được dialyzed hai lần chống lại 1 lít đệm A 25 ° C. và áp dụng cho một 250 × 10 mm SynChropak AX-300 anion trao đổi hệ HPLC cột trước khi equilibrated trong đệm một (Rainin Corp, Emeryville, California) tại một tỷ lệ lưu lượng 2.4 ml/phút. Mẫu đã trong bộ đệm A. ràng buộc protein được eluted với một tuyến tính 50 ml gradient từ 100 mM đến 700 mM NaCl trong bộ đệm A 2.4 ml/phút. BST DNA polymerase hoạt động eluted tại một sức mạnh ion tương ứng với một nồng độ muối của giữa về cách 0.2 và cách 0.4 M NaCl.Trong một số trường hợp, đầy đủ độ dài tinh khiết Bst polymerase tiếp tục được điều trị bằng một protease để tạo ra một hình thức cắt ngắn hoạt động của enzyme. Trong trường hợp này, tinh khiết Bst polymerase (0,33 mg/ml) được điều trị với subtilisin trong bộ đệm A tỷ lệ (w/w) 1:200 của protease Bst polymerase ở 25 ° C. Hỗn hợp phản ứng được ủ tại 25° C. trong 40 phút, và phản ứng bị chấm dứt với việc bổ sung các PMSF với một nồng độ cuối cùng 1 mm. Các đoạn proteolytic hoạt động của Bst DNA polymerase được tinh chế bằng cách sử dụng một 60 × 10 mm cột của hydroxyapatite (HA) (HT Gel sinh học, Phòng thí nghiệm BioRad, Richmond, California) theo phương pháp của Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623 (1974) tiết lộ trong đó bằng văn bản này được kết hợp bởi tham chiếu ở đây. Cột Hà equilibrated trong 20 mM Dinatriyfosfat (pH 7.0), và Bst polymerase eluted với một độ dốc tuyến tính từ 20 đến 350 mM sodium phosphate (pH 7.0) tại một tỷ lệ lưu lượng 1 ml/phút. Protein hoạt động eluted tại một sức mạnh ion tương ứng với về cách 0.3 M Dinatriyfosfat. Các phần phân đoạn hoạt động được gộp lại.

Kết quả (Việt) 2:

Các phần phân đoạn hoạt động tổng hợp từ các bước phosphocellulose được thẩm tách hai lần so với 1 lít Buffer A ở 25 ° C. và áp dụng cho một 250 × 10 mm SynChropak AX-300 cột trao đổi anion HPLC trước cân bằng trong Buffer A (Rainin Corp., Emeryville , Calif.) với tốc độ dòng chảy 2,4 ml / phút. Mẫu đều trong Buffer A. ràng buộc protein được tách rửa với một linear gradient năm mươi ml từ 100 đến 700 mM mM NaCl trong Buffer A 2,4 ml / phút. Hoạt động polymerase Bst DNA tách rửa ở một cường độ ion tương ứng với một nồng độ muối trong khoảng từ 0,2 và 0,4 M NaCl. Trong một số trường hợp, chiều dài toàn Bst polymerase tinh khiết được điều trị thêm với một protease để tạo ra một hình thức cắt ngắn hoạt động của các enzyme. Trong trường hợp như vậy, tinh khiết Bst polymerase (0,33 mg / ml) đã được điều trị với subtilisin trong Buffer A có 1: 200 (w / w) tỷ lệ protease để Bst polymerase ở 25 ° C. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 25 ° C . 40 phút, và các phản ứng đã được chấm dứt với sự bổ sung của PMSF đến nồng độ cuối cùng của 1 mM. Đoạn phân giải protein hoạt động của Bst DNA polymerase đã tinh khiết sử dụng một cột 60 × 10 mm của hydroxyapatite (HA) (Bio Gel-HT, BioRad Laboratories, Richmond, Calif.) Theo phương pháp của Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45: 623 (1974) mà việc tiết lộ tại đây được đưa tài liệu tham khảo trong tài liệu này. Cột HA được cân bằng trong 20 mM sodium phosphate (pH 7.0), và Bst polymerase được tách rửa với một gradient tuyến tính 20-350 mM sodium phosphate (pH 7.0) với tốc độ dòng chảy của 1 ml / phút. Các protein hoạt động rửa giải tại một sức mạnh ion tương ứng với khoảng 0,3 M sodium phosphate. Các phần hoạt động được gộp chung.