. Protoplast fusion SURYA PRAKASH G

. Protoplast fusion SURYA PRAKASH GAUTAM Ph.D Asstt.Professor HIPER, Nadaun
2. Contents:IntroductionIsolation of Protoplast Fusion products - the hybrids and cybrids techniques of protoplast fusionProcedure for successful somatic hybridization Applications
3. Protoplast FusionPROTOPLAST FUSION:•A protoplast is a plant, bacterial or fungal cell that had its cell wall completely or partially removedusing either mechanical or enzymatic means. Protoplasts: Have their cell wall entirely removed Spheroplasts: Have their cell wall only partially removed•More generally protoplast refers to that unit of biology which is composed of a cells nucleus andthe surrounding protoplasmic materials.•Protoplast are naked spherical cells obtained from plants by removing of cell wall and it iscultivated in liquid as well as on solid media.•The protoplast an excellent tool for the synthesis of novel combination of genes and are essentialpart of the overall process required for the genetic manipulation of plants.
4. Protoplast FusionISOLATION OF PROTOPLAST:Protoplast can be isolated from almost all plant parts i.e.roots,leaves,fruits,tubers, root nodules,endosperm,pollen mother cell, callus andsuspension culture.Protoplasts are isolated from cells by two methods-MECHANICAL METHOD MECHANICAL METHOD:ENZYMATIC METHOD The cells are kept in a suitable plasmolyticum & cut with a fine knife, so that protoplast are released from cells cut through the cell wall, when the tissue is again deplasmolysed. This method is suitable for isolation of protoplasts from higher plant tissue such as leaf, bulb scale, fruit epidermis,raddish roots
5. Protoplast Fusion DISADVANTAGE- It yields a very small number of protoplasts after a rather tedious procedure. It is not suitable for isolating protoplasts from meristmatic & less vacuolated cells.A. Tissue is cut along the dotted line B. Release of Protoplasts from Damaged cells
6. Protoplast FusionEnzymes for the preparation of protoplasts•Cell walls are made of a variety of polysaccharides. Protoplasts can be made bydegrading cell walls with a mixture of the appropriate polysaccharide-degradingenzymes:•During and subsequent to digestion of the cell wall, the protoplast becomes verysensitive to osmotic stress. This means cell wall digestion and protoplast storage mustbe done in an isotonic solution to prevent rupture of the plasma membrane. Type of cell Enzyme Plant cells Cellulase, pectinase, xylanase Gram-positive bacteria Lysozyme (+EDTA) Fungal cells Chitinase
7. Method of isolation of protoplastFig. Method of isolation of protoplast
8. A. Shoot Culture B. Remove Leaves C. Cut LeavesG.Protoplasts F. Centrifuge 500g 1 minReady for E. Isolated Protoplasts D. Incubate inPurification Enzyme 8
9. Purification, culture and regeneration of protoplastsFig: Purification, culture and regeneration of protoplasts
10. PURIFICATION:Only two commonly used methods:-1.Sedimentation & washing2.Flotation1. In this method, the crude protoplasts suspension is centrifuged at low speed (50-100g for 5 min). The intact protoplasts form a pellet and supernatant containing cell debris can be pipetted off. The pellet is gently resuspended in fresh culture media plus mannitol and rewashed. This process is repeated two or three times to get relatively clean protoplast preparation.2. Protoplasts being lighter (low density) then other cell debris, gradients may be used, which will allow the protoplasts to float and the cell debris to sediment. A concentrated solution of mannitol, Sorbitol and sucrose (0.3-0.6M) can be used as a gradient and crude protoplasts suspension may be centrifuged in this gradient at an appropriate speed. Protoplasts can be pipetted off from the top of the tube after centrifugation.
11. FUSION PRODUCTS - THE HYBRIDS AND CYBRIDSFUSION PRODUCTS - THE HYBRIDS AND CYBRIDSFusion of cytoplasm of two protoplasts results in coalescence of cytoplasms. Thenuclei of two protoplasts may or may not fuse together even after fusion ofcytoplasms.The binucleate cells are known as heterokaryon or heterocyte .When nuclei are fused the cells are known as hybrid or synkaryocyte .Only cytoplasms fuse and genetic information from one of the two nuclei is lostis known as cybrid i.e. cytoplasmic hybrid or heteroplast .
12. TECHNIQUES OF PROTOPLAST FUSION1. Spontaneous fusion2. Mechanical fusion3. Induced fusion1. During isolation of protoplasts for culture, when enzymatic degradation of cellwalls is affected, some of the protoplasts, lying in close proximity, may undergofusion to produce homokaryons or homokaryocytes, each with 2-40 nuclei.The occurrence of multinucleate fusion bodies is more frequent, when protoplasts areprepared from actively dividing cells.
13. Somatic hybridization is generally used for fusion of protoplasts either from twodifferent species (interspecific fusion) or from two diverse sources belonging to thesame species.To achieve this objective, spontaneous fusion may be of no value, and induced fusio

Kết quả (Việt) 1:

. Protoplast fusion SURYA PRAKASH GAUTAM tiến sĩ Asstt.Professor HIPER, Nadaun2. nội dung: IntroductionIsolation Protoplast Fusion sản phẩm - lai và cybrids kỹ thuật của protoplast fusionProcedure cho thành công Soma hybridization ứng dụng3. protoplast FusionPROTOPLAST FUSION: • một protoplast là một thực vật, tế bào vi khuẩn hay nấm có vách tế bào của nó hoàn toàn hoặc một phần removedusing cơ khí hoặc enzym có nghĩa là. Protoplasts: Có tường di động của họ hoàn toàn loại bỏ Spheroplasts: có tường di động của họ chỉ có một phần removed•More thường protoplast đề cập đến rằng đơn vị sinh học gồm một hạt nhân tế bào và protoplasmic xung quanh vật liệu. •Protoplast trần truồng các tế bào hình cầu thu được từ các nhà máy bằng cách loại bỏ tế bào, và nó iscultivated trong chất lỏng cũng như trên các phương tiện truyền thông. •mã rắn protoplast một công cụ tuyệt vời cho sự tổng hợp của tiểu thuyết tổ hợp gen và essentialpart của quá trình tổng thể yêu cầu thao tác di truyền của nhà máy.4. protoplast FusionISOLATION của PROTOPLAST: Protoplast có thể được phân lập từ hầu hết các thực vật phần i.e.roots,leaves,fruits,tubers, gốc nốt, nội nhũ, tế bào mẹ phấn hoa, callus andsuspension văn hóa. Protoplasts đang bị cô lập từ các tế bào bằng hai phương pháp-MECHANICAL phương pháp cơ học phương pháp: ENZYMATIC phương pháp các tế bào được lưu giữ trong một thích hợp plasmolyticum & cắt bằng một con dao tốt, do đó protoplast được phát hành từ các tế bào cắt giảm thông qua tế bào, khi các tế bào là một lần nữa deplasmolysed. Phương pháp này là thích hợp cho sự cô lập của protoplasts từ cao mô cây như lá, bóng đèn quy mô, lớp biểu bì của trái cây, rễ raddish5. protoplast Fusion bất lợi-It sản lượng một số rất nhỏ của protoplasts sau khi một thủ tục khá buồn tẻ. It là không thích hợp để cô lập protoplasts từ meristmatic & ít tế bào vacuolated. A. mô cắt dọc theo dòng rải rác sinh phát hành các Protoplasts từ Damaged tế bào6. protoplast FusionEnzymes chuẩn bị protoplasts•Cell tường được làm bằng một loạt các polysaccharides. Protoplasts có thể được làm thành tế bào bydegrading với một hỗn hợp của polysaccharide thích hợp-degradingenzymes:•During và sau khi tiêu hóa tế bào, protoplast trở thành verysensitive để osmotic căng thẳng. Điều này có nghĩa là tế bào tiêu hóa và lưu trữ protoplast mustbe thực hiện trong một dung dịch đẳng trương để ngăn ngừa vỡ màng. Loại tế bào thực vật men tiêu hóa các tế bào Cellulase, pectinase, vi khuẩn Gram dương xylanase Lysozyme (+ EDTA) tế bào nấm Chitinase7. phương pháp tách biệt của protoplastFig. Phương pháp của sự cô lập của protoplast8. A. bắn văn hóa sinh loại bỏ lá C. cắt LeavesG.Protoplasts F. máy ly tâm 500g 1 minReady cho E. cô lập Protoplasts mất ấp cho nở inPurification Enzyme 89. thanh lọc, văn hóa và tái sinh của protoplastsFig: thanh lọc, văn hóa và tái sinh của protoplasts10. thanh lọc: chỉ có hai thường sử dụng phương pháp:-1.Sedimentation & washing2. Flotation1. Trong phương pháp này, việc đình chỉ thô protoplasts ly ở tốc độ thấp (50-100g cho 5 phút). Protoplasts nguyên vẹn hình thành một miếng và supernatant có chứa mảnh vỡ tế bào có thể được pipetted ra. Miếng nhẹ nhàng resuspended tươi văn hóa truyền thông cộng mannitol và rewashed. Quá trình này là lặp đi lặp lại hai hoặc ba lần để có được tương đối sạch sẽ protoplast preparation.2. Protoplasts là nhẹ hơn (mật độ thấp), sau đó mảnh vỡ tế bào, chuyển sắc có thể được sử dụng, mà sẽ cho phép protoplasts đến nổi và các mảnh vỡ tế bào để trầm tích. Một giải pháp tập trung mannitol, Sorbitol và sucrose (0.3-0.6M) có thể được sử dụng như một hệ thống treo gradient và thô protoplasts có thể được centrifuged trong này gradient độ thích hợp. Protoplasts có thể được pipetted ra từ đầu của ống sau số.11. FUSION PRODUCTS - THE HYBRIDS AND CYBRIDSFUSION PRODUCTS - THE HYBRIDS AND CYBRIDSFusion of cytoplasm of two protoplasts results in coalescence of cytoplasms. Thenuclei of two protoplasts may or may not fuse together even after fusion ofcytoplasms.The binucleate cells are known as heterokaryon or heterocyte .When nuclei are fused the cells are known as hybrid or synkaryocyte .Only cytoplasms fuse and genetic information from one of the two nuclei is lostis known as cybrid i.e. cytoplasmic hybrid or heteroplast .12. TECHNIQUES OF PROTOPLAST FUSION1. Spontaneous fusion2. Mechanical fusion3. Induced fusion1. During isolation of protoplasts for culture, when enzymatic degradation of cellwalls is affected, some of the protoplasts, lying in close proximity, may undergofusion to produce homokaryons or homokaryocytes, each with 2-40 nuclei.The occurrence of multinucleate fusion bodies is more frequent, when protoplasts areprepared from actively dividing cells.13. Somatic hybridization is generally used for fusion of protoplasts either from twodifferent species (interspecific fusion) or from two diverse sources belonging to thesame species.To achieve this objective, spontaneous fusion may be of no value, and induced fusio

Kết quả (Việt) 2:

. Phản ứng tổng hợp nguyên hình SURYA PRAKASH Gautam Ph.D Asstt.Professor Hiper, Nadaun
2. Nội dung: IntroductionIsolation sản phẩm Protoplast Fusion - lai và kỹ thuật cybrids của fusionProcedure nguyên hình cho các ứng dụng hybridization soma thành công
3. Nguyên hình FusionPROTOPLAST FUSION: • Một nguyên hình là một thực vật, tế bào vi khuẩn hoặc nấm có vách tế bào của nó hoàn toàn hoặc một phần removedusing phương tiện hoặc cơ khí hoặc enzym. Bào trần: có vách tế bào của họ hoàn toàn bị loại bỏ Spheroplasts: Có vách tế bào của họ chỉ có một phần loại bỏ • Nói chung kiểu mẫu đầu tiên đề cập đến đơn vị sinh học trong đó gồm một tế bào nhân andthe vật liệu nguyên sinh xung quanh • nguyên hình là những tế bào hình cầu thường thu được từ thực vật bằng cách loại bỏ. của vách tế bào và nó iscultivated trong chất lỏng cũng như trên môi trường rắn. • các nguyên hình là một công cụ tuyệt vời cho sự tổng hợp của tổ hợp mới của các gen và essentialpart của quá trình tổng thể cần thiết cho các thao tác di truyền của cây trồng.
4. Nguyên hình FusionISOLATION HÀNH nguyên hình: nguyên hình có thể được phân lập từ gần như tất cả các bộ phận của cây ieroots, lá, quả, củ, nốt sần, nội nhũ, tế bào phấn hoa mẹ, culture.Protoplasts sẹo andsuspension được phân lập từ tế bào bằng hai phương pháp-MECHANICAL PHƯƠNG PHÁP CƠ KHÍ PHƯƠNG PHÁP: ENZYMATIC PHƯƠNG PHÁP các tế bào này được giữ trong một plasmolyticum phù hợp và cắt bằng một con dao tốt, vì vậy nguyên hình được phát hành từ các tế bào cắt qua vách tế bào, khi mô được nữa deplasmolysed. Phương pháp này là thích hợp để phân lập các tế bào trần từ mô thực vật bậc cao như lá, quy mô bóng đèn, biểu bì trái cây, rễ raddish
5. Nguyên hình Fusion DISADVANTAGE- It mang lại một số lượng rất nhỏ các tế bào trần sau khi một thủ tục khá tẻ nhạt. It là không thích hợp để cô lập các tế bào trần từ cells.A meristmatic & ít vacuolated. Mô được cắt dọc theo đường chấm chấm B. Phát hành tế bào trần từ các tế bào bị hư hại
6. Nguyên hình FusionEnzymes cho việc chuẩn bị của các tế bào trần • bức tường di động được thực hiện của một loạt các polysaccharides. Bào trần có thể được thực hiện bydegrading thành tế bào với một hỗn hợp của các polysaccharide-degradingenzymes thích hợp: • Trong và sau đó để tiêu hóa của các tế bào, các nguyên hình trở nên căng thẳng verysensitive để thẩm thấu. Điều này có nghĩa tiêu hóa thành tế bào và mustbe lưu trữ kiểu mẫu đầu tiên được thực hiện trong một dung dịch đẳng trương để ngăn chặn vỡ màng tế bào. Loại tế bào tế bào thực vật Enzyme Cellulase, pectinase, vi khuẩn Gram dương xylanase Lysozym (+ EDTA) tế bào nấm chitinase
7. Phương pháp phân lập protoplastFig. Phương pháp phân lập nguyên hình
8. A. Bắn Văn hóa B. Di Lá C. Cắt LeavesG.Protoplasts F. ly tâm 500g 1 minReady cho E. Isolated bào trần D. Ủ inPurification Enzyme 8
9. sạch, văn hóa và tái sinh của protoplastsFig: sạch, văn hóa và tái tạo tế bào trần
10. Lọc: Chỉ có hai phương pháp thường được sử dụng: -1.Sedimentation & washing2.Flotation1. Trong phương pháp này, các tế bào trần treo thô được ly tâm ở tốc độ thấp (50-100g cho 5 phút). Các tế bào trần nguyên vẹn hình thành một viên và nổi chứa các mảnh vụn tế bào có thể được pipetted tắt. Các viên được nhẹ nhàng lơ lửng trong môi trường nuôi cấy tươi cộng với mannitol và rewashed. Quá trình này được lặp đi lặp lại hai hoặc ba lần để có được tương đối sạch preparation.2 nguyên hình. Bào trần được nhẹ hơn (mật độ thấp) mảnh vỡ tế bào sau đó khác, gradient có thể được sử dụng, mà sẽ cho phép các tế bào trần nổi và các mảnh vỡ tế bào để bùn đất. Một giải pháp tập trung của mannitol, sorbitol và sucrose (0.3-0.6M) có thể được sử dụng như một gradient và tế bào trần thô đình chỉ có thể được ly tâm trong gradient này tại một tốc độ thích hợp. Bào trần có thể được pipetted ra từ phía trên cùng của ống sau khi ly tâm.
11. HÀNG FUSION - THE LAI VÀ CÁC SẢN PHẨM CYBRIDSFUSION - THE LAI VÀ CYBRIDSFusion của tế bào chất của tế bào trần hai kết quả trong sự hợp nhất của cytoplasms. Thenuclei của hai tế bào trần có thể hoặc không thể hợp nhất với nhau ngay cả sau khi các tế bào binucleate hợp ofcytoplasms.The được gọi là heterokaryon hoặc heterocyte .When hạt nhân được hợp nhất các tế bào được gọi là lai hoặc synkaryocyte .Only cytoplasms cầu chì và các thông tin di truyền từ một trong hai hạt nhân được gọi là lostis cybrid tức lai tế bào chất hoặc heteroplast.
12. KỸ THUẬT CỦA CÁC nguyên hình FUSION1. Fusion2 tự phát. Fusion3 Cơ. Fusion1 gây ra. Trong thời gian cô lập tế bào trần cho văn hóa, khi suy thoái enzyme cellwalls bị ảnh hưởng, một số các tế bào trần, nằm ​​gần nhau, có thể undergofusion để sản xuất homokaryons hoặc homokaryocytes, mỗi 2-40 nuclei.The xuất hiện của các cơ quan hợp multinucleate là thường xuyên hơn, khi tế bào trần areprepared từ các tế bào chủ động phân chia.
13. Lai soma thường được sử dụng cho các phản ứng tổng hợp tế bào trần hoặc từ loài twodifferent (khác loài nhiệt hạch) hoặc từ hai nguồn khác nhau thuộc thesame species.To đạt được mục tiêu này, phản ứng tổng hợp tự nhiên có thể không có giá trị, và gây ra FUSIO