We have developed an efficient opti

We have developed an efficient optimization technique, ‘biased mutation-assembling’, for improving protein properties such as thermostability. In this strategy, a mutant library is constructed using the overlap extension polymerase chain reaction technique with DNA fragments from wild-type and phenotypically advantageous mutant genes, in which the number of mutations assembled in the wild-type gene is stochastically controlled by the mixing ratio of the mutant DNA fragments to wild-type fragments. A high mixing ratio results in a mutant composition biased to favor multiple-point mutants. We applied this strategy to improve the thermostability of prolyl endopeptidase from Flavobacterium meningosepticum as a case study and found that the proportion of thermostable mutants in a library increased as the mixing ratio was increased. If the proportion of thermostable mutants increases, the screening effort needed to find them should be reduced. Indeed, we isolated a mutant with a 1200-fold longer activity half-life at 60°C than that of wild-type prolyl endopeptidase after screening only 2000 mutants from a library prepared with a high mixing ratio. Our results indicate that an aggressive accumulation of advantageous mutations leads to an increase in the quality of the mutant library and a reduction in the screening effort required to find superior mutants.

Kết quả (Việt) 1:

Chúng tôi đã phát triển một hiệu quả tối ưu hóa kỹ thuật, 'thiên vị lắp ráp đột biến', để cải thiện tính chất đạm như thermostability. Trong chiến lược này, một thư viện đột biến được xây dựng bằng cách sử dụng kỹ thuật phản ứng dây chuyền chồng chéo lên nhau mở rộng trùng hợp với những mảnh ADN từ loại hoang và thuận lợi phenotypically đột biến gen, trong đó số lượng đột biến lắp ráp trong loại hoang gen ngẫu được kiểm soát bởi lệ mảnh DNA đột biến để loại hoang mảnh vỡ, trộn. Một tỷ lệ cao trộn kết quả trong một thành phần đột biến thiên vị để ưu tiên người đột biến nhiều điểm. Chúng tôi áp dụng chiến lược này để cải thiện thermostability hydroxylase endopeptidase từ Flavobacterium meningosepticum như là một trường hợp nghiên cứu và tìm thấy rằng tỷ lệ các đột biến trong một thư viện tăng khi tỉ lệ trộn được tăng lên. Nếu tỷ lệ các đột biến tăng, các nỗ lực kiểm tra cần thiết để tìm thấy chúng nên được giảm. Thật vậy, chúng tôi cô lập một đột biến với một 1200-fold dài hoạt động chu kỳ bán rã ở 60° C hơn loại hoang hydroxylase endopeptidase sau khi xem xét các đột biến đĩa từ một thư viện chuẩn bị với một tỷ lệ cao trộn. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng một tích tụ tích cực của đột biến thuận lợi dẫn đến sự gia tăng chất lượng của thư viện đột biến và một sự giảm trong nỗ lực kiểm tra được yêu cầu để tìm người đột biến cao cấp.

Kết quả (Việt) 2:

Chúng tôi đã phát triển một kỹ thuật tối ưu hóa hiệu quả, 'thiên vị đột biến, lắp ráp, cải thiện tính chất protein như chịu nhiệt. Trong chiến lược này, một thư viện đột biến được xây dựng bằng cách sử dụng phần mở rộng chồng lên nhau kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase với những mảnh DNA từ hoang dại và gen đột biến kiểu hình thuận lợi, trong đó số lượng đột biến, lắp ráp tại gen hoang dại được stochastically kiểm soát bởi tỉ lệ pha trộn của các đoạn DNA đột biến để mảnh hoang dại. Một trộn cao kết quả tỷ lệ trong một thành phần đột biến thiên thiên đột biến đa điểm. Chúng tôi áp dụng chiến lược này để cải thiện Tính chịu nhiệt của prolyl endopeptidase từ Flavobacterium meningosepticum như một trường hợp nghiên cứu và thấy rằng tỷ lệ đột biến chịu nhiệt trong một thư viện tăng do tỷ lệ pha trộn được tăng lên. Nếu tỷ lệ đột biến chịu nhiệt tăng, các nỗ lực sàng lọc cần thiết để tìm thấy chúng nên được giảm. Thật vậy, chúng ta phân lập được một đột biến với 1.200 lần hoạt động nửa cuộc đời còn ở 60 ° C so với các loại hoang dã prolyl endopeptidase sau khi sàng lọc chỉ có 2000 người đột biến từ một thư viện chuẩn bị với một tỷ lệ pha trộn cao. Kết quả của chúng tôi cho thấy một sự tích lũy các đột biến tích cực thuận lợi dẫn đến sự gia tăng trong chất lượng của các thư viện và giảm đột biến trong các nỗ lực sàng lọc cần thiết để tìm đột biến cao.