Amplicon ladders were constructed t

Amplicon ladders were constructed to identify bands in DGGE fingerprints of pasta filata cheeses (Coppola et al., 2001), yoghurts, and probiotic preparations (Fasoli et al., 2003; Temmerman et al., 2003). The identification by using ladders has been also applied by Meroth et al. (2003) to identify bacteria during sourdough fermentation and by van Beek and Priest (2002) for the identification of bands in PCR-DGGE fingerprints from malt whisky fermentation. Both papers report cases of comigration of lactobacilli: the members of the L. acidophilus group were indistinguishable in DGGE gels (van Beek and Priest, 2002), as well as the couples L. acidophilus/L. crispatus and L. pontis/L. sanfranciscensis (Meroth et al., 2003). However, in
both cases, it was possible to obtain a satisfactory separation by using different primer pairs or adjusting the gradient conditions in DGGE. In fact, changing the 16S region to analyse is an immediate solution to comigration problems even though this, most of the time, changes all the conditions of analysis and leads to examination of many sets of fingerprints. Another disadvantage of using these kinds of ladder is the possibility of having multiple copies of the 16S rRNA and thus multiple bands displayed for only one species; this would make the identification more difficult. Moreover, sometimes the differences in migration distances of the bands in DGGE are not that wide, which makes the comparison difficult and the identification not absolutely reliable. In such cases, the best solution is the sequencing of the band
whose identification by comparison with the ladder is not exactly convincing. However, the use of amplicon ladders in DGGE analysis is useful to normalise the gel patterns also by using appropriate software packages. According to Temmerman et al. (2003), each band position can be
registered in a database and this normalisation enables the comparison of different DGGE gels, provided that they consist of the same denaturing gradient gel. This is important especially when long analyses are performed involving a large number of samples.
8. Eucaryotic communities
The PCR-DGGE approach has been also profitably applied to study eucaryotic communities that very
often play an important role in food fermentations. Ben Omar and Ampe (2000) and Ampe et al. (2001) looked for yeasts and fungi in pozol and cassava samples, respectively, during fermentation. The authors performed analyses by using PCR-DGGE amplicons of 18S rDNA, but in both cases, only bands corresponding to nonmicrobial DNA could be distinguished in the DGGE profiles. 18S rDNA-PCR-DGGE was also used by Ro¨ling et al. (2001) to identify yeasts and fungi in vanilla beans during curing. While it was possible to identify fungal species by PCR-DGGE after enrichment of the samples in culture media, no DGGE profile could be obtained from DNA directly extracted from the samples during the curing. A valid PCR-DGGE method to monitor yeast
population was developed by Cocolin et al. (2000). DGGE analysis was performed on amplified products of variable domains of the 26S rDNA from yeast DNA and the protocol was validated in a laboratoryscale wine fermentation, allowing to detect as little as 103 cfu ml
1 and to distinguish at least four different yeast species. The developed approach was then used to monitor the yeast populations during commercial wine fermentations (Cocolin et al., 2001a). It was possible to profile the bacterial community at each stage of the fermentation and to identify yeast species belonging to the genera Metschnikowia, Candida, and Pichia at the beginning of the fermentation, and Saccharomyces cerevisiae as dominant member during later stages of the process. The same approach was also used to demonstrate the effectiveness of S.
cerevisiae during commercial wine fermentation: the band corresponding to this species occurred as dominant in the DGGE profiles of all the samples analysed during the fermentation (Cocolin et al., 2002b). Another interesting application of PCR-DGGE to wine fermentation was reported by Mills et al. (2002), who assessed the yeast diversity in Botrytis-affected wine fermentations. This work demonstrated that the fermentation temperature has a strong influence on the growth of non-Saccharomyces yeasts, which dramatically decreases in heated fermentations. The authors also observed that populations of Candida occurred as active during the whole fermentation according to the results of the DGGE analysis of 26S rDNA fragments obtained by both PCR and RT-PCR (Mills et al., 2002). Moreover, some other interesting observations are reported in the same study (Mills et al., 2002)

Kết quả (Việt) 2:

Thang Amplicon được xây dựng để xác định các ban nhạc trong DGGE dấu vân tay của mì pho mát filata, sữa chua, và các chế phẩm probiotic (Coppola et al., 2001) (Fasoli et al, 2003;. Temmerman et al., 2003). Việc xác định bằng cách sử dụng thang cũng đã được áp dụng bởi Meroth et al. (2003) để xác định vi khuẩn trong quá trình lên men và bột chua và van Beek và Priest (2002) cho việc xác định các ban nhạc ở PCR-DGGE dấu vân tay từ quá trình lên men rượu whisky mạch nha. Cả hai giấy tờ báo cáo trường hợp của comigration của lactobacilli: các thành viên của nhóm acidophilus L. không thể phân biệt trong gel DGGE (van Beek và Priest, 2002), cũng như các cặp vợ chồng L. acidophilus / L. crispatus và L. PONTIS / L. sanfranciscensis (Meroth et al., 2003). Tuy nhiên, trong
cả hai trường hợp, nó đã có thể có được một tách thỏa đáng bằng cách sử dụng cặp mồi khác hoặc điều chỉnh các điều kiện gradient trong DGGE. Trong thực tế, việc thay đổi vùng 16S để phân tích là một giải pháp trước mắt để comigration vấn đề mặc dù điều này, hầu hết thời gian, thay đổi tất cả các điều kiện của phân tích và dẫn đến kiểm tra nhiều bộ dấu vân tay. Một bất lợi của việc sử dụng các loại thang là khả năng có nhiều bản sao của 16S rRNA và do đó nhiều băng tần hiển thị cho chỉ có một loài; điều này sẽ làm cho việc xác định khó khăn hơn. Hơn nữa, đôi khi sự khác biệt về khoảng cách di chuyển của các ban nhạc ở DGGE không phải là rộng, mà làm cho sự so sánh khó khăn và việc xác định không hoàn toàn đáng tin cậy. Trong trường hợp như vậy, giải pháp tốt nhất là trình tự của các ban nhạc
mà xác định bằng cách so sánh với các bậc thang là không chính xác có sức thuyết phục. Tuy nhiên, việc sử dụng thang amplicon trong phân tích DGGE là hữu ích để bình thường hóa các mẫu gel cũng bằng cách sử dụng gói phần mềm phù hợp. Theo Temmerman et al. (2003), mỗi vị trí nhạc có thể được
đăng ký tại một cơ sở dữ liệu và chuẩn hóa này cho phép so sánh các gel DGGE khác nhau, miễn là chúng bao gồm các giống gel biến tính gradient. Điều này là đặc biệt quan trọng khi phân tích dài được thực hiện liên quan đến một số lượng lớn các mẫu.
8. Cộng đồng Eucaryotic
Phương pháp PCR-DGGE đã được áp dụng cũng có lợi nhuận để nghiên cứu cộng đồng eucaryotic rằng rất
thường đóng một vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm. Ben Omar và Ampe (2000) và Ampe et al. (2001) nhìn cho nấm men và nấm trong pozol và sắn mẫu, tương ứng, trong quá trình lên men. Các tác giả tiến hành phân tích bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE amplicon 18S rDNA, nhưng trong cả hai trường hợp, chỉ có ban nhạc tương ứng với DNA nonmicrobial có thể được phân biệt trong các cấu DGGE. 18S rDNA-PCR-DGGE cũng đã được sử dụng bởi Röling et al. (2001) để xác định nấm men và nấm trong đậu vani trong chữa. Trong khi nó đã có thể xác định các loài nấm bằng phương pháp PCR-DGGE sau khi làm giàu của các mẫu trong môi trường nuôi cấy, không có cấu DGGE có thể thu được từ DNA trực tiếp chiết xuất từ các mẫu trong quá trình đóng rắn. Một phương pháp PCR-DGGE hợp lệ để theo dõi men
dân được phát triển bởi Cocolin et al. (2000). Phân tích DGGE được thực hiện trên các sản phẩm khuếch đại của lĩnh vực biến của 26S rDNA từ DNA men và các giao thức đã được xác nhận trong một quá trình lên men rượu vang laboratoryscale, cho phép phát hiện ít nhất là 103 cfu ml? 1 và để phân biệt ít nhất bốn loài nấm men khác nhau. Các cách tiếp cận phát triển sau đó được sử dụng để giám sát các quần thể nấm men trong quá trình lên men rượu vang thương mại (Cocolin et al., 2001a). Đó là có thể cấu hình các cộng đồng vi khuẩn ở mỗi giai đoạn của quá trình lên men và xác định các loài nấm men thuộc chi Metschnikowia, Candida, và Pichia vào đầu của quá trình lên men, và Saccharomyces cerevisiae thành viên như thống trị trong suốt giai đoạn sau của quá trình. Các phương pháp tương tự cũng được sử dụng để chứng minh tính hiệu quả của S.
cerevisiae trong quá trình lên men rượu vang thương mại: các ban nhạc tương ứng với loài này xảy ra như chiếm ưu thế trong các cấu DGGE của tất cả các mẫu phân tích trong quá trình lên men (Cocolin et al, 2002b.). Một ứng dụng thú vị của PCR-DGGE để lên men rượu vang đã được báo cáo bởi Mills et al. (2002), người đã đánh giá tính đa dạng nấm men trong quá trình lên men rượu vang Botrytis bị ảnh hưởng. Công việc này đã chứng minh rằng nhiệt độ lên men có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của nấm men Saccharomyces không, điều này làm giảm đáng kể trong quá trình lên men được làm nóng. Các tác giả cũng quan sát thấy rằng quần thể các Candida đã xảy ra khi hoạt động trong suốt quá trình lên men theo các kết quả phân tích DGGE của mảnh 26S rDNA thu được bằng cả hai phương pháp PCR và RT-PCR (Mills et al., 2002). Hơn nữa, một số quan sát thú vị khác được báo cáo trong các nghiên cứu tương tự (Mills et al., 2002)