Embryonic specific markers are not

Embryonic specific markers are not enriched in protocorm and PLB tissues
Expression of embryonic markers such as BBM, LEC1, FUS3, and ABI3s are not only enriched in zygotic and somatic embryos, some of their functions have also been demonstrated to be sufficient to establish embryonic fate during somatic embryogenesis (Braybrook and Harada, 2008; Smertenko and Bozhkov, 2014). Unlike somatic embryonic tissues observed in other plant species, PaLEC1 and PaFUS3 mRNAs were hardly detectable in protocorms and PLBs. The mRNAs of PaBBM and PaABI3L2 accumulated to low levels in 10-day-old protocorms and were hardly detectable in developing PLBs (Table 1 and Fig. 3B). The level of PaABIL1 mRNA was relatively high in abundance in developing protocorms and low inabundance in developing PLBs (Table 1 and Fig. 3B). In addition, mRNAs of the two embryonic marker genes, PaWRI1 and PaOLE1 whose functions are important for accumulation of storage reserves during the maturation phase of embryogenesis (Cernac and Benning, 2004; Hsieh and Huang, 2004) were expressed in very low abudance or undetectable in developing protocorms and PLBs. In situ hybridization also confirmed the lack of detectable PaLEC1 and PaBBM mRNA in developing PLBs (Fig. 4B and 4C). Therefore, expression of the embryonic marker genes was not correlated with initiation and development of PLBs. The ability of PaLEC1 and PaBBM to induce somatic embryogenesis was verified in Arabidopsis. Expression of the PaBBM and PaLEC1 proteins was verified by western blot analysis (Supplemental Fig. S5A). Overexpression of 35S:PaBBM324
eGFP or 35S:eGFP- PaLEC1/35S:PaLEC1-eGFP (Fig. 5A and 5B) but not the empty vector (Supplemental Fig. S5B and S5C) caused ectopic production of cotyledons from somatic tissues. The embryonic specific genes such as Ole, Coleosin, Cruciferin 3 (CRU3), ABI3, and FUS3 were upregulated in somatic embryonic culture tissues of the transgenic plants (Fig. 5C and 5D). In addition, triacylglycerols that accumulate in embryonic tissues and stained intensely with the Sudan Red 7B, were also accumulated in embryonic-like tissues of 35S:PaLEC-eGFP and 35S:eGFP331
PaBBM transgenic lines (Fig. 5E). Moreover, overexpression of eGFP-PaLEC1 rescued lec1-1 desiccation tolerant phenotype (Fig. 5E), supporting that PaLEC1 is the functional ortholog of Arabidopsis LEC1. The 35S:eGFP-PaBBM construct failed to be generated and was therefore omitted from this study. In short, PaLEC1 and PaBBM genes are evolutionarily conserved and capable of inducing the somatic embryonic program.
In addition to surveying transcripti 337 onal factors that displayed enriched expression pattern during seed development, we also examined SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK) whose expression has been shown to be associated with somatic embryogenesis (Schmidt et al., 1997; Hecht et al., 2001;

Kết quả (Việt) 1:

Phôi đánh dấu cụ thể không được phong phú trong protocorm và các mô PLBBiểu hiện của các dấu hiệu phôi thai như BBM, LEC1, FUS3 và ABI3s không chỉ phong phú trong zygotic và Soma phôi, một số chức năng của họ cũng đã được chứng minh là đủ để thiết lập số phận phôi trong Soma embryogenesis (Braybrook và Harada, 2008; Smertenko và Bozhkov, năm 2014). Không giống như Soma mô phôi quan sát thấy ở các loài thực vật khác, PaLEC1 và PaFUS3 mRNAs đã hầu như không phát hiện ở protocorms và PLBs. MRNAs PaBBM và PaABI3L2 tích lũy cho các cấp độ thấp trong 10 ngày tuổi protocorms và đã hầu như không phát hiện trong việc phát triển PLBs (bảng 1 và hình 3B). Mức độ PaABIL1 mRNA là tương đối cao trong sự phong phú trong việc phát triển protocorms và inabundance thấp trong việc phát triển PLBs (bảng 1 và hình 3B). Ngoài ra, mRNAs của hai phôi marker Gene, PaWRI1 và PaOLE1 có chức năng rất quan trọng để tích lũy lượng dự trữ trong giai đoạn trưởng thành của embryogenesis (Cernac và Benning, năm 2004; Hsieh và hoàng, 2004) đã được bày tỏ trong abudance rất thấp hoặc không thể phát hiện trong việc phát triển protocorms và PLBs. In situ lai cũng xác nhận việc thiếu phát hiện PaLEC1 và PaBBM mRNA trong việc phát triển PLBs (hình 4B và 4C). Vì vậy, biểu hiện của gen phôi đánh dấu không tương quan với khởi xướng và phát triển của PLBs. Khả năng gây Soma embryogenesis PaLEC1 và PaBBM đã được xác minh trong Arabidopsis. Biểu hiện của các protein PaBBM và PaLEC1 đã được xác minh bằng cách phân tích phương Tây blot (bổ sung sung. S5A). Tế của 35S:PaBBM324eGFP hoặc 35S:eGFP-PaLEC1 / 35S:PaLEC1-eGFP (hình 5A và 5B) nhưng không có sản phẩm nào vector (bổ sung sung. S5B và S5C) gây ra ngoài tử cung sản xuất lá mầm từ Soma mô. Các phôi cụ thể gen như Ole, Coleosin, Cruciferin 3 (CRU3), ABI3, và FUS3 đã là upregulated trong nền văn hóa phôi Soma mô của các cây trồng biến đổi gen (hình 5 c và 5 D). Ngoài ra, triacylglycerols mà tích tụ trong các mô phôi thai và màu mạnh mẽ với màu đỏ Sudan 7B, cũng đã được tích lũy trong phôi thai giống như mô của 35S:PaLEC-eGFP và 35S:eGFP331PaBBM biến đổi gen dòng (hình 5E). Hơn nữa, tế eGFP-PaLEC1 cứu lec1-1 khô khoan dung kiểu hình (hình 5E), hỗ trợ PaLEC1 là ortholog Arabidopsis LEC1, chức năng. 35S:eGFP-xây dựng PaBBM đã không được tạo ra và do đó được bỏ qua từ nghiên cứu này. Trong ngắn hạn, PaLEC1 và PaBBM gen là cuốn bảo tồn và có khả năng gây ra các chương trình phôi Soma.Ngoài việc khảo sát transcripti 337 yếu tố onal Hiển thị mô hình biểu hiện phong phú trong hạt giống phát triển, chúng tôi cũng kiểm tra Soma EMBRYOGENESIS thụ KINASE (SERK) có biểu hiện đã cho thấy được liên kết với Soma embryogenesis (Schmidt et al., năm 1997; Hecht et al., 2001;

Kết quả (Việt) 2:

Đánh dấu cụ thể phôi không được làm giàu ở protocorm và PLB mô
Biểu hiện của dấu phôi như BBM, LEC1, FUS3, và ABI3s không chỉ làm giàu ở zygotic và phôi soma, một số chức năng của họ cũng đã được chứng minh là đủ để thiết lập số phận phôi trong phôi soma (Braybrook và Harada, 2008; Smertenko và Bozhkov, 2014). Không giống như các mô phôi soma quan sát thấy ở các loài thực vật khác, PaLEC1 và PaFUS3 mRNA là hầu như không thể phát hiện được trong protocorm và PLBs. Các mRNA của PaBBM và PaABI3L2 tích lũy đến mức thấp trong protocorm 10 ngày tuổi và hầu như không thể phát hiện được trong việc phát triển PLBs (Bảng 1 và Hình. 3B). Mức PaABIL1 mRNA tương đối cao trong sự phong phú trong việc phát triển protocorm và inabundance thấp trong việc phát triển PLBs (Bảng 1 và Hình. 3B). Ngoài ra, các mRNA của hai gen đánh dấu phôi, PaWRI1 và PaOLE1 có chức năng rất quan trọng cho sự tích lũy dự trữ lưu trữ trong giai đoạn trưởng thành của phôi (Cernac và Benning, 2004; Hsieh và Huang, 2004) được thể hiện trong abudance rất thấp hoặc không thể phát hiện trong việc phát triển protocorm và PLBs. Lai tạo tại chỗ cũng xác nhận việc thiếu PaLEC1 phát hiện và PaBBM mRNA trong PLBs phát triển (Hình. 4B và 4C). Do đó, biểu hiện của các gen đánh dấu phôi thai được không tương quan với việc bắt đầu và phát triển của PLBs. Khả năng của PaLEC1 và PaBBM để tạo ra phôi soma được xác nhận trong Arabidopsis. Biểu hiện của protein PaBBM và PaLEC1 đã được xác nhận qua sự phân tích dấu vết tây (Bổ sung hình. S5A). Quá mức của 35S: PaBBM324
EGFP hoặc 35S: eGFP- PaLEC1 / 35S: (. Hình 5A và 5B) PaLEC1-EGFP nhưng không phải là vector rỗng (Supplemental Hình S5B và S5C.) Khiến sản xuất ngoài tử cung của lá mầm từ các mô soma. Các gen cụ thể phôi như Ole, Coleosin, Cruciferin 3 (CRU3), ABI3, và FUS3 được upregulated trong các mô nuôi cấy phôi soma của cây trồng chuyển gen (Hình. 5C và 5D). Ngoài ra, các triacylglycerol tích lũy trong các mô phôi và nhuộm màu mạnh mẽ với Sudan Red 7B, cũng đã được tích lũy trong các mô phôi như của 35S: PaLEC-EGFP và 35S: eGFP331
PaBBM dòng biến đổi gen (5E hình.). Hơn nữa, quá mức của EGFP-PaLEC1 cứu khô lec1-1 kiểu hình kháng (Hình. 5E), hỗ trợ mà PaLEC1 là ortholog chức năng của Arabidopsis LEC1. 35S: EGFP-PaBBM xây dựng không thể được tạo ra và do đó đã bỏ đi từ nghiên cứu này. Trong ngắn, PaLEC1 và PaBBM gen được tiến hóa được bảo tồn và có khả năng gây các chương trình phôi soma.
Ngoài khảo sát transcripti 337 yếu tố onal mà hiển thị mô hình biểu hiện phong phú trong phát triển hạt giống, chúng tôi cũng đã kiểm tra soma phôi thụ kinase (SERK) có biểu hiện đã được thấy có liên quan với phôi soma (Schmidt et al, 1997;.. Hecht et al, 2001;