2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Thực vật và tăng trưởng các điều kiện
C. sativa trồng trong nhà kính (GM-GH) đã gieo vào ngày 1
của May 2014 và phát triển trong điều kiện kiểm soát ở mức 25 1C ngày / 16 1C
đêm, độ ẩm 50-60%, và giữ theo một chu kỳ sáng 16 h (dài
ngày), với ánh sáng bổ sung được cung cấp khi mức độ môi trường giảm xuống
dưới 400 mmol m? 2 s? 1
. Harvest thường xảy ra 95 ngày sau khi
gieo (bổ sung Bảng 3).
2.2. Thế hệ của cây chuyển gen
chuyển gen C. dòng sativa được tạo ra như trước đây
được mô tả (Ruiz-Lopez et al., 2014). Các vectơ thiết kế đã được
chuyển vào Agrobacterium tumefaciens chủng AGL1. C. sativa
cụm hoa được đắm mình trong việc đình chỉ Agrobacterium cho
30 s mà không áp dụng bất kỳ chân không. Hạt giống biến đổi gen thể hiện
con đường DHA được xác định bằng cách kiểm tra trực quan cho DsRed
hoạt động. Hạt giống thu hoạch từ cây chuyển được chiếu sáng
bằng đèn LED màu xanh lá cây. Hạt huỳnh quang được hình dung
bằng cách sử dụng ống kính lọc màu đỏ. Trong mọi trường hợp, không có nhiễu loạn kiểu hình đã được
quan sát như là một kết quả của sự thay đổi của các thành phần dầu hạt giống.
2.3. Xây dựng Vector
Các cấu trúc được sử dụng để chuyển đổi cây trồng, chứa một
tập hợp tối ưu của các gen cho EPA và DHA tổng hợp (Hình 1b.): Một Δ6-
gen desaturase từ Ostreococcus tauri17 (OtΔ6) (Domergue et al,.
2005a), cùng với một Δ6 gen elongase axit béo từ Physcomitrella
patens (PSE1), một gen Δ5-desaturase từ Thraustochytrium
sp. (TcΔ5) (Wu et al., 2005), một gen Δ12-desaturase từ
Phytophthora sojae (PsΔ12) để nâng cao mức oflinoleate-CoA
(như là chất nền cho các enzyme OtΔ6) và ω3-desaturase từ
nấm Phytophthora infestans (Pi-ω3 ) (Bauer et al., 2012) để tăng
chuyển đổi của ARA EPA, OtElo5, một elongase axit béo O. tauri Δ5
gen (Meyer et al., 2004) và EhΔ4, một gen Δ4-desaturase từ
Emiliania huxleyi (Sayanova et al., 2011) cả hai bên conlinin
quảng bá và OCS terminators, đã được thêm vào p5_EPA
xây dựng (Ruiz-Lopez et al., 2013, 2014). Các vector nơi
chứa một dấu DsRed để lựa chọn hình ảnh qua coatspecific hạt giống
biểu hiện của DsRed. Tất cả các gen đã được nhân bản vô tính cá nhân
dưới sự kiểm soát của nhà tổ chức hạt giống cụ thể, và sau đó kết hợp
vào một vector chuyển T-DNA đơn như đã mô tả trước đây
(Ruiz-Lopez et al., 2013). Tất cả các khung đọc mở cho desaturases
và elongases đã được tổng hợp lại (GenScript Corporation, NJ;
www.genscript.com) và codon được tối ưu hóa cho biểu hiện trong
đang được dịch, vui lòng đợi..
