2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant material and growth conditions
C. sativa grown in the glasshouse (GM-GH) was sown on the 1st
of May 2014 and grown in controlled conditions at 25 1C day/16 1C
night, 50–60% humidity, and kept under a 16 h photoperiod (long
day), with supplemental light provided when ambient levels fell
below 400 μmol m
2 s
1
. Harvest usually occurred 95 days after
sowing (Supplementary Table 3).
2.2. Generation of transgenic plants
Transgenic C. sativa lines were generated as previously
described (Ruiz-Lopez et al., 2014). The designed vectors were
transferred into Agrobacterium tumefaciens strain AGL1. C. sativa
inflorescences were immersed in the Agrobacterium suspension for
30 s without applying any vacuum. Transgenic seeds expressing
the DHA pathway were identified by visual screening for DsRed
activity. Seeds harvested from transformed plants were illuminated
using a green LED light. Fluorescent seeds were visualised
using a red lens filter. In all cases, no phenotypic perturbation was
observed as a result of modification of the seed oil composition.
2.3. Vector construction
The construct used for plant transformation, contained an
optimal set of genes for EPA and DHA synthesis (Fig. 1b): a Δ6-
desaturase gene from Ostreococcus tauri17 (OtΔ6) (Domergue et al.,
2005a), together with a Δ6 fatty acid elongase gene from Physcomitrella
patens (PSE1), a Δ5-desaturase gene from Thraustochytrium
sp. (TcΔ5) (Wu et al., 2005), a Δ12-desaturase gene from
Phytophthora sojae (PsΔ12) to enhance the levels oflinoleate-CoA
(as substrate for the OtΔ6 enzyme) and an ω3-desaturase from
Phytophthora infestans (Pi-ω3) (Bauer et al., 2012) to increase the
conversion of ARA to EPA, OtElo5, an O. tauri Δ5 fatty acid elongase
gene (Meyer et al., 2004) and EhΔ4, a Δ4-desaturase gene from
Emiliania huxleyi (Sayanova et al., 2011) both flanked by conlinin
promoters and OCS terminators, were added to the p5_EPA
construct (Ruiz-Lopez et al., 2013, 2014). The destination vector
contained a DsRed marker for visual selection via seed coatspecific
expression of DsRed. All genes were individually cloned
under the control of seed-specific promoters, and then combined
into a single T-DNA transformation vector as previously described
(Ruiz-Lopez et al., 2013). All open reading frames for desaturases
and elongases were re-synthesised (GenScript Corporation, NJ;
www.genscript.com) and codon-optimized for expression in

Kết quả (Việt) 1:

2. tài liệu và phương pháp2.1. điều kiện vật chất và sự tăng trưởng thực vậtC. sativa trồng trong nhà kính (GM-GH) được gieo trên 1Tháng năm 2014 và phát triển trong kiểm soát các điều kiện tại 25 1 c ngày/16 1 CBan đêm, 50-60% độ ẩm, và lưu giữ dưới một photoperiod 16 h (longngày), với ánh sáng bổ sung được cung cấp khi môi trường xung quanh mức độ giảmdưới 400 μmol m 2 s 1. Thu hoạch thường xảy ra 95 ngày sauCác máy gieo hạt (bổ sung bảng 3).2.2. hệ thực vật biến đổi genBiến đổi gen C. sativa dòng đã được tạo ra như trước đâyMô tả (Ruiz-Lopez và ctv., năm 2014). Thiết kế Vector đãchuyển vào Agrobacterium tumefaciens căng AGL1. C. sativacụm hoa được đắm mình trong việc đình chỉ Agrobacterium cho30 s mà không áp dụng bất kỳ máy hút. Hạt giống biến đổi gen thể hiệncon đường DHA được xác định bởi các kiểm tra trực quan cho DsRedhoạt động. Hạt được thu hoạch từ cây chuyển được chiếu sángbằng cách sử dụng một đèn LED màu xanh lá cây. Huỳnh quang hạt giống đã được visualisedbằng cách sử dụng một bộ lọc ống kính màu đỏ. Trong mọi trường hợp, không có nhiễu loạn kiểu hình làquan sát như là kết quả của thành phần dầu hạt giống.2.3. vector xây dựngXây dựng được sử dụng để biến đổi thực vật, chứa mộtCác thiết lập tối ưu của các gen cho tổng hợp EPA và DHA (hình 1b): Δ6 -desaturase gen từ Ostreococcus tauri17 (OtΔ6) (Domergue et al.,2005a), cùng với một gen elongase Δ6 acid béo từ Physcomitrellapatens (PSE1), một gen Δ5-desaturase từ ThraustochytriumSP. (TcΔ5) (Wu et al., 2005), Δ12-desaturase gen từPhytophthora sojae (PsΔ12) để nâng cao cấp oflinoleate-CoA(như là chất nền cho enzym OtΔ6) và một ω3 desaturase từPhytophthora infestans (Pi-ω3) (Bauer et al., 2012) để tăng cácchuyển đổi ARA EPA, OtElo5, một O. tauri Δ5 acid béo elongaseGene (Meyer và ctv., năm 2004) và EhΔ4, một gen Δ4-desaturase từEmiliania huxleyi (Sayanova và ctv., 2011) cả hai bên conlininquảng bá và OCS terminators, đã được thêm vào p5_EPAxây dựng (Ruiz Lopez et al., 2013, 2014). Điểm đến vectorcó một điểm đánh dấu DsRed cho các lựa chọn hình ảnh thông qua hạt coatspecificbiểu hiện của DsRed. Tất cả gen riêng lẻ đã được nhân bảndưới sự kiểm soát của quảng bá đặc trưng cho hạt giống, và sau đó kết hợpvào một T-DNA duy nhất chuyển đổi vector như trước đây được mô tả(Ruiz-Lopez et al., năm 2013). Tất cả mở đọc khung cho desaturasesvà elongases đã tái khẩu (tập đoàn GenScript, NJ;www.genscript.com) và codon tối ưu hóa cho các biểu hiện ở

Kết quả (Việt) 2:

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Thực vật và tăng trưởng các điều kiện
C. sativa trồng trong nhà kính (GM-GH) đã gieo vào ngày 1
của May 2014 và phát triển trong điều kiện kiểm soát ở mức 25 1C ngày / 16 1C
đêm, độ ẩm 50-60%, và giữ theo một chu kỳ sáng 16 h (dài
ngày), với ánh sáng bổ sung được cung cấp khi mức độ môi trường giảm xuống
dưới 400 mmol m? 2 s? 1
. Harvest thường xảy ra 95 ngày sau khi
gieo (bổ sung Bảng 3).
2.2. Thế hệ của cây chuyển gen
chuyển gen C. dòng sativa được tạo ra như trước đây
được mô tả (Ruiz-Lopez et al., 2014). Các vectơ thiết kế đã được
chuyển vào Agrobacterium tumefaciens chủng AGL1. C. sativa
cụm hoa được đắm mình trong việc đình chỉ Agrobacterium cho
30 s mà không áp dụng bất kỳ chân không. Hạt giống biến đổi gen thể hiện
con đường DHA được xác định bằng cách kiểm tra trực quan cho DsRed
hoạt động. Hạt giống thu hoạch từ cây chuyển được chiếu sáng
bằng đèn LED màu xanh lá cây. Hạt huỳnh quang được hình dung
bằng cách sử dụng ống kính lọc màu đỏ. Trong mọi trường hợp, không có nhiễu loạn kiểu hình đã được
quan sát như là một kết quả của sự thay đổi của các thành phần dầu hạt giống.
2.3. Xây dựng Vector
Các cấu trúc được sử dụng để chuyển đổi cây trồng, chứa một
tập hợp tối ưu của các gen cho EPA và DHA tổng hợp (Hình 1b.): Một Δ6-
gen desaturase từ Ostreococcus tauri17 (OtΔ6) (Domergue et al,.
2005a), cùng với một Δ6 gen elongase axit béo từ Physcomitrella
patens (PSE1), một gen Δ5-desaturase từ Thraustochytrium
sp. (TcΔ5) (Wu et al., 2005), một gen Δ12-desaturase từ
Phytophthora sojae (PsΔ12) để nâng cao mức oflinoleate-CoA
(như là chất nền cho các enzyme OtΔ6) và ω3-desaturase từ
nấm Phytophthora infestans (Pi-ω3 ) (Bauer et al., 2012) để tăng
chuyển đổi của ARA EPA, OtElo5, một elongase axit béo O. tauri Δ5
gen (Meyer et al., 2004) và EhΔ4, một gen Δ4-desaturase từ
Emiliania huxleyi (Sayanova et al., 2011) cả hai bên conlinin
quảng bá và OCS terminators, đã được thêm vào p5_EPA
xây dựng (Ruiz-Lopez et al., 2013, 2014). Các vector nơi
chứa một dấu DsRed để lựa chọn hình ảnh qua coatspecific hạt giống
biểu hiện của DsRed. Tất cả các gen đã được nhân bản vô tính cá nhân
dưới sự kiểm soát của nhà tổ chức hạt giống cụ thể, và sau đó kết hợp
vào một vector chuyển T-DNA đơn như đã mô tả trước đây
(Ruiz-Lopez et al., 2013). Tất cả các khung đọc mở cho desaturases
và elongases đã được tổng hợp lại (GenScript Corporation, NJ;
www.genscript.com) và codon được tối ưu hóa cho biểu hiện trong