1. IntroductionTaura syndrome virus

1. Introduction

Taura syndrome virus (TSV) was first discovered in Ecuador in 1992 (Jimenez, 1992). It was a serious cause of shrimp mortality for reared Penaeus (Litopenaeus) vannamei (P. van- namei) in the Americas where it spreads principally through the regional and international transfer of live postlarvae and brood- stock (Brock, 1997). TSV is a small, non-enveloped icosahedral virus containing a single-stranded positive-sense RNA genome of 10,205 nucleotides (Bonami et al., 1997; Mari et al., 2002) and was classified in the family Dicistroiridae (Mayo, 2002, 2005). The capsid is comprised of three major proteins, i.e. 55, 40, 24 kDa designated VP1, VP2 and VP3, respectively as well as a 58 kDa minor protein designated V0 (Bonami et al., 1997; Mari et al., 2002).


∗ Corresponding author at: CENTEX Shrimp, Faculty of Science, Mahidol University, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand. Tel.: [phone];
fax: [phone].
E-mail address: [e-mail] (W. Kiatpathomchai).

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay is a novel approach that allows amplification of DNA with high specificity, sensitivity and rapidity under isothermal conditions. LAMP, originally described by Notomi et al. (2000), can amplify target nucleic acid to 109 copies at 60–65 ◦C within 1 h. The method relies on autocycling strand displacement DNA syn- thesis by the Bst DNA polymerase large fragment, a DNA polymerase with high strand displacement activity, and a set of two specially designed inner primers and two outer primers. LAMP is highly specific for the target sequence because of the recognition of the target sequence by six independent sequences in the initial stage and by four independent sequences in the later stages of the LAMP reaction. As the reaction is conducted under isothermal conditions, it can be performed with a sim- ple and inexpensive water bath. Therefore, a thermal cycler is not required. As there is no time loss in thermal changes, the amplification efficiency of the LAMP method is extremely high (Parida et al., 2004; Savan et al., 2005).
The development of a loop-mediated isothermal amplifica- tion (LAMP) assay for detection of shrimp white spot syndrome virus (WSSV) DNA was described by Kono et al. (2004). The


0166-0934/$ – see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.jviromet.2007.06.007

126 W. Kiatpathomchai et al. / Journal of Virological Methods 146 (2007) 125–128


LAMP assay is also useful for RNA template detection upon the use of reverse transcriptase together with DNA polymerase (Notomi et al., 2000; Whiting and Champoux, 1998). In this paper, the RT-LAMP assay for detection of TSV RNA in P. vannamei is described.

2. Materials and methods

2.1. Shrimp samples

TSV infected P. vannamei were collected from shrimp farms in Samutsakorn province, Thailand. Shrimp haemolymph (50 µl) was collected in a syringe preloaded with 100 µl (i.e., two volumes) of 10% (w/v) sodium citrate solution (Kiatpathomchai et al., 2004).

2.2. RNA extraction

Total RNA was extracted from 90 µl of haemolymph-citrate mixture using 750 µl of TRI Reagent® (Molecular Research Center Inc., USA). After incubation for 5 min with vigorous mixing, 200 µl of chloroform was added with vigorous mixing and the tube was incubated for 10 min before centrifugation at 12,000 × g for 10 min. The aqueous phase was transferred to a fresh tube followed by precipitating with 500 µl of 100% iso- propanol for 10 min on ice and centrifuged at 12,000 × g for 10 min. The pellet was washed with 70% (v/v) ethanol, air dried and dissolved in 50 µl of RNase-free water (Kiatpathomchai et al., 2004). RT-PCR amplification was carried out using 2 µl of this RNA solution as template.

2.3. Primers for RT-LAMP

RT-LAMP primers for TSV were designed according to the published sequence of TSV structural gene (Gen-Bank accession number: AF277674; Mari et al., 2002) using Primer Explorer version 3 (http://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html). The details of the primers are given in Table 1.

2.4. Optimization of LAMP condition

The RT-LAMP reactions were carried out at 60, 63 and 65 ◦C for 1 h, followed by heat inactivation at 90 ◦C for 2 min to ter- minate the reaction. The reaction mixture contained 2 µM each of inner primers TSV-FIP and TSV-BIP, 0.2 µM each of outer primers TSV-F3 and TSV-B3, 1.4 mM of dNTP mix (Promega, Madison, WI, USA), 0.6 M betaine (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM MgSO4, 8 U of Bst DNA polymerase (large

fragment; New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA), 1× of the supplied buffer, 0.125 U of AMV Reverse transcriptase (Promega) and the specified amount of template RNA in a final volume of 25 µl. Different amounts of RNA template were used. Uninfected samples and reaction mix without template were
included as the negative controls. To determine the optimum time for amplification, the lamp reaction was carried out at 63 ◦C for 30, 45 and 60 min.

Kết quả (Việt) 1:

1. giới thiệuVirus hội chứng Taura (TSV) được phát hiện ở Ecuador năm 1992 (Jimenez, 1992). Đó là một nguyên nhân nghiêm trọng của tỷ lệ tử vong tôm cho nuôi Penaeus (Litopenaeus) kém (P. van namei) ở châu Mỹ, nơi nó lây lan chủ yếu thông qua việc chuyển vùng và quốc tế trực tiếp postlarvae và brood cổ (Brock, 1997). TSV là một nhỏ, không enveloped icosahedral virus có chứa một ý nghĩa tích cực duy nhất-stranded RNA gen của 10.205 nucleotide (Bonami et al., năm 1997; Mari và ctv, 2002) và được phân loại trong họ Dicistroiridae (tháng năm, năm 2002, 2005). Capsid gồm có ba protein chính, tức là 55, 40, 24 kDa tên VP1, VP2 và VP3, tương ứng, cũng như một protein nhỏ 58 kDa, khu vực cho phép V0 (Bonami et al., năm 1997; Mari et al., 2002).∗ Corresponding tác giả tại: CENTEX tôm, khoa khoa học, đại học Mahidol, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand. Điện thoại: + 66 2 2015878;Fax: + 66 2 3547344.Địa chỉ e-mail: [e-mail] (W. Kiatpathomchai). Trung gian Loop khuếch đại cách nhiệt (đèn) khảo nghiệm là một cách tiếp cận mới cho phép các khuếch đại của DNA với cao đặc trưng, nhạy cảm và nhanh chóng trong điều kiện cách nhiệt. ĐÈN, ban đầu được miêu tả bởi Notomi et al. (2000), có thể khuếch đại axit nucleic nhắm mục tiêu đến các bản sao 109 tại 60-65 ◦C trong vòng 1 h. Các phương pháp dựa trên autocycling strand thuyên DNA syn-luận án bằng Bst DNA polymerase lớn mảnh, một DNA polymerase với cao strand thuyên hoạt động và một bộ của hai thiết kế đặc biệt bên trong chất nền, mồi và hai lớp lót bên ngoài. ĐÈN là rất cụ thể cho mục tiêu tự do sự công nhận của dãy mục tiêu bởi sáu trình tự độc lập trong giai đoạn ban đầu và bốn trình tự độc lập trong giai đoạn sau của phản ứng đèn. Như phản ứng được tiến hành trong điều kiện cách nhiệt, nó có thể được thực hiện với một sim-ple và rẻ tiền nước tắm. Vì vậy, một người đạp xe máy nhiệt là không cần thiết. Như không có không có mất thời gian thay đổi nhiệt, khuếch đại hiệu quả của phương pháp đèn là rất cao (Parida et al., năm 2004; Savan et al., 2005).Sự phát triển của một vòng lặp, Trung gian cách nhiệt amplifica-tion (đèn) khảo nghiệm phát hiện tôm trắng tại chỗ hội chứng virus (WSSV) DNA được miêu tả bởi Kono et al. (2004). Các 0166-0934 / $ – xem trước vấn đề © 2007 Elsevier B.V Tất cả các quyền. Doi:10.1016/j.jviromet.2007.06.007 126 W. Kiatpathomchai et al. / tạp chí Virological phương pháp 146 (2007) 125 – 128 Khảo nghiệm đèn cũng là hữu ích cho mẫu là nhà phát hiện RNA sau khi sử dụng reverse transcriptase cùng với DNA polymerase (Notomi et al., 2000; Whiting và Champoux, 1998). Trong bài báo này, khảo nghiệm RT-đèn cho phát hiện của TSV RNA trong P. vannamei được miêu tả.2. tài liệu và phương pháp2.1. tôm mẫuTSV nhiễm P. vannamei được thu thập từ các trang trại tôm ở tỉnh Samutsakorn, Thái Lan. Tôm Hemolymph (50 ml) được thu thập trong một ống tiêm preloaded với 100 ml (tức là, hai tập) 10% (w/v) sodium citrate giải pháp (Kiatpathomchai và ctv., 2004).2.2. RNA khai thácTất cả RNA được chiết xuất từ 90 ml hỗn hợp Hemolymph citrate sử dụng 750 ml TRI Reagent® (phân tử nghiên cứu Trung tâm Inc., USA). Sau khi ủ cho 5 phút với pha trộn mạnh mẽ, 200 ml của chloroform được thêm vào với pha trộn mạnh mẽ và các ống được ủ trong 10 phút trước khi số 12.000 × g cho 10 phút. Pha dung dịch được chuyển đến một ống tươi theo kết tủa với 500 ml 100% tiêu chuẩn iso-propanol cho 10 phút trên băng và ly 12.000 × g cho 10 phút. Miếng đã được rửa sạch với cồn 70% (v/v), máy sấy khô và hòa tan trong 50 ml nước miễn phí RNase (Kiatpathomchai và ctv., 2004). RT-PCR khuếch đại được thực hiện bằng cách sử dụng 2 ml của giải pháp RNA này như là bản mẫu.2.3. lớp lót cho các RT-đènRT-đèn lớp lót cho các TSV được thiết kế theo trình tự công bố của TSV cấu trúc gen (số gia nhập ngân hàng Gen: AF277674; Mari và ctv, 2002) sử dụng mồi Explorer phiên bản 3 (http://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html). Các chi tiết của các chất nền, mồi được đưa ra trong bảng 1.2.4. tối ưu hóa tình trạng đènPhản ứng của RT-đèn đã được thực hiện tại ◦C 60, 63 và 65 cho 1 h, sau đó là nhiệt ngừng hoạt động tại 90 ◦C cho 2 phút để ter-minate phản ứng. Phản ứng hỗn hợp chứa 2 μm mỗi bên trong lớp lót TSV-FIP và TSV-BIP, cách 0.2 μm mỗi bên ngoài lớp lót TSV-F3 và TSV-B3, 1.4 mM của hỗn hợp dNTP (Promega, Madison, WI, Mỹ), 0,6 M hydrochlorid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ), 6 mM MgSO4, 8 U Bst DNA polymerase (lớn mảnh; New Biolabs Inc, Beverly, MA, USA), 1 x cung cấp đệm, 0.125 U AMV Reverse transcriptase (Promega) và số tiền của mẫu RNA trong tập cuối cùng của 25 ml. số tiền khác nhau của RNA mẫu được sử dụng. Mẫu nhiễm và phản ứng pha trộn mà không có bản mẫubao gồm các điều khiển tiêu cực. Để xác định thời gian tối ưu để khuếch đại, phản ứng đèn được thực hiện tại 63 ◦C cho 30, 45 đến 60 phút.

Kết quả (Việt) 2:

1. Giới thiệu

Taura hội chứng virus (TSV) lần đầu tiên được phát hiện ở Ecuador vào năm 1992 (Jimenez, 1992). Đó là một nguyên nhân nghiêm trọng của tử vong tôm Penaeus (Litopenaeus) tôm thẻ chân trắng nuôi (P. van- Namei) ở châu Mỹ, nơi nó lây lan chủ yếu thông qua việc chuyển giao khu vực và quốc tế của postlarvae sống và cổ brood- (Brock, 1997). TSV là một nhỏ, không vỏ, rút icosahedral là genome RNA dương cảm giác sợi đơn của 10.205 nucleotide (Bonami et al, 1997;.. Mari et al, 2002) và được xếp vào gia đình Dicistroiridae (Mayo, 2002, 2005). Capsid bao gồm ba loại protein lớn, tức là 55, 40, 24 kDa được VP1, VP2 và VP3, tương ứng cũng như một protein nhỏ 58 kDa được V0 (Bonami et al, 1997;. Mari et al., 2002).


* tác giả tương ứng tại: tôm CENTEX, Khoa Khoa học, Đại học Mahidol, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand. Tel .: [phone];
fax: [phone].
E-mail: [e-mail] (W. Kiatpathomchai). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) khảo nghiệm là một phương pháp mới cho phép khuếch đại DNA với độ đặc hiệu cao, độ nhạy và nhanh chóng trong điều kiện đẳng nhiệt. LAMP, ban đầu được mô tả bởi Notomi et al. (2000), có thể khuếch đại mục tiêu axit nucleic tới 109 bản sao tại 60-65 ◦C trong vòng 1 giờ. Phương pháp này dựa trên các luận án autocycling sợi chuyển DNA hội chứng bởi polymerase đoạn Bst DNA lớn, một DNA polymerase với hoạt động chuyển sợi cao, và một tập hợp của hai loại sơn lót bên trong được thiết kế đặc biệt và hai đoạn mồi bên ngoài. LAMP là rất cụ thể cho các chuỗi mục tiêu vì sự công nhận của các chuỗi đích sáu chuỗi độc lập trong giai đoạn ban đầu và bốn chuỗi độc lập trong các giai đoạn sau của phản ứng LAMP. Khi phản ứng được tiến hành trong điều kiện đẳng nhiệt, nó có thể được thực hiện với một ví giản và tắm nước rẻ tiền. Vì vậy, một chu trình nhiệt là không cần thiết. Vì không có mất thời gian trong sự thay đổi nhiệt, hiệu quả khuếch đại của phương pháp LAMP là cực kỳ cao (Parida et al, 2004;. Savan et al., 2005). Sự phát triển của một loop-mediated isothermal amplifica- sự (LAMP) Xét nghiệm phát hiện tôm virus hội chứng đốm trắng (WSSV) DNA đã được mô tả bởi Kono et al. (2004). Các 0166-0934 / $ - xem vấn đề trước © 2007 Elsevier BV Tất cả quyền được bảo lưu. doi: 10,1016 / j.jviromet.2007.06.007 126 W. Kiatpathomchai et al. / Tạp chí Khoa virus học Phương pháp 146 (2007) 125-128 ĐÈN khảo nghiệm cũng rất hữu ích cho RNA mẫu phát hiện khi sử dụng sao chép ngược cùng với DNA polymerase (Notomi et al, 2000;. Whiting và Champoux, 1998). Trong bài báo này, các thử nghiệm RT-LAMP phát hiện của TSV RNA trong P. vannamei được mô tả. 2. Vật liệu và phương pháp 2.1. Mẫu tôm TSV nhiễm P. vannamei được thu thập từ các trang trại nuôi tôm ở tỉnh Samutsakorn, Thái Lan. Huyết tương tôm (50 ml) đã được thu thập trong một ống tiêm cài đặt sẵn với 100 ml (ví dụ, hai tập) là 10% (w / v) dung dịch natri citrat (Kiatpathomchai et al., 2004). 2.2. RNA chiết RNA tổng số được tách chiết từ 90 ml hỗn hợp huyết tương-citrate sử dụng 750 ml TRI Reagent® (Molecular Research Center Inc., USA). Sau khi ủ trong 5 phút với pha trộn mạnh mẽ, 200 ml chloroform đã được bổ sung với pha trộn mạnh mẽ và ống đã được ủ trong 10 phút trước khi ly tâm ở 12.000 × g trong 10 phút. Giai đoạn dịch đã được chuyển giao cho một ống tươi sau kết tủa với 500 ml 100% propanol ISO- trong 10 phút trên băng và ly tâm ở 12.000 × g trong 10 phút. Các viên đã được rửa sạch với 70% (v / v) ethanol, không khí khô và hòa tan trong 50 ml RNase-miễn phí nước (Kiatpathomchai et al., 2004). Khuếch đại RT-PCR được thực hiện sử dụng 2 ml dung dịch RNA này như mẫu. 2.3. Sơn lót dùng cho RT-LAMP mồi RT-LAMP cho TSV được thiết kế theo trình tự xuất bản của TSV gen cấu trúc (số nhập Gen-Ngân hàng: AF277674; Mari et al., 2002) sử dụng Primer Explorer phiên bản 3 (http: // primerexplorer. jp / lamp3.0.0 / index.html). Các chi tiết của đoạn mồi được cho trong bảng 1. 2.4. Tối ưu hóa các điều kiện ĐÈN Các phản ứng RT-LAMP được thực hiện tại 60, 63 và 65 ◦C trong 1 giờ, sau đó bất hoạt nhiệt ở 90 ◦C trong 2 phút để thổ minate phản ứng. Hỗn hợp phản ứng chứa 2 mM mỗi mồi bên trong TSV-FIP và TSV-BIP, 0,2 mM mỗi mồi ngoài TSV-F3 và TSV-B3, 1,4 mM hỗn hợp dNTP sẽ (Promega, Madison, WI, USA), 0,6 M betain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM MgSO 4, 8 U bst DNA polymerase (lớn mảnh; New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA), 1 × của bộ đệm được cung cấp, 0.125 U của AMV Xếp transcriptase (Promega) và số tiền quy định của mẫu RNA trong một thể tích cuối cùng của 25 ml. Lượng khác nhau của mẫu RNA đã được sử dụng. Mẫu không bị nhiễm và hỗn hợp phản ứng mà không cần mẫu được bao gồm như là các điều khiển âm. Để xác định thời gian tối ưu để khuếch đại, phản ứng đèn được thực hiện tại 63 ◦C 30, 45 và 60 phút.