Recombinant pET 200/D-TOTO vector w

Recombinant pET 200/D-TOTO vector was subjected to
digestion and PCR. SacI and SmaI were chosen for analysisof faeG-1NT and fedA-C gene, respectively. Digestion of
recombinant vectors with SacI or SmaI produced two linearized
DNA fragments of 6.5 kb (faeG-1NT) or 6.2 kb
(fedA-C), as expected indicating that the genes were indeed
inserted within the vector. PCR analysis showed that genes
amplified with the expected sizes of 829 bp (faeG-1NT)
and 516 bp (faeA-C).
Expressions of F107-C and K88-1NT fimbrial subunits
were performed in E. coli BL21 StarTM (DE3) at 37 C on
LB medium supplemented with 1 % glucose and 50 lg/ml
kanamycin. The culture was carried out on a rotation
shaker with speed of 200 rpm to an OD600 of 0.8. Isopropyl
b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final
concentration of 0.5 mM for induction. An induction time
was extended from 2 to 10 h, and the cells were harvested
by centrifugation at 8,000 rpm/4 C for 1 min. The freezing
and thawing at 42 C was performed with three repeats
to break cells and recombinant proteins were recovered by
extraction buffer (50 mM K3PO4 pH 7.8, 400 mM NaCl,
100 mM KCl, 10 % glycerol and 0.5 % Trixton X-100).
Expression levels of fimbrial subunits were assayed by
electrophoresis on 12 % (w/v) polyacrylamide gel. The gel
was then stained with Coomassie Blue R-250 and image
was analysed by Quality One software (ver 4.1, BioRad).
Expressions of the faeG-1NT and fedA-C genes were
expected to produce proteins of *31 kDa (27 kDa K88-
1NT subunit and 3.7 kDa fusion fragment of pET 200/DTOTO
vector) and 22 kDa (18 kDa F07-C subunit and
3.7 kDa fusion fragment of pET 200/D-TOTO vector). For
the inclusion body fraction, strong bands of 22 and 31 kDa
were obtained in cultures induced with IPTG (Fig. 1). Protein
bands of K88-1NT and F107-C subunits in unsoluble
fractions are very weak (data not shown). For the uninduced
cells, no protein band of expected sizes was observed, suggesting
that induction with IPTG is required for expression of
faeG-1NT and fedA-C fimbrial subunit genes.
Imberechts et al. [10] isolated F107 major fimbrial subunit
gene (fedA) from edema disease strain 107/86 of E. coli. The
fedA gene was sequenced, an open reading frame that codes
for a protein with 170 amino acids, including a 21 amino acid
signal peptide, was found. The protein without the signal
sequence (mature peptide) has a calculated molecular weight
of more 16 kDa. Verdonck et al. [7] cloned F4 fimbrial
adhesin FaeG monomers from E. coli strain GIS26 and
expressed in E. coli BL21 (DE3) with a molecular weight of
about 32 kDa. Hu et al. [9] expressed extracellularly F4 fi-
mbrial adhesin FaeG by recombinant Lactococcus lactis.
Besides, Huang et al. [17] expressed successfully FaeG, a
major subunit of K88ad fimbriae in transgenic tobacco plant
with a molecular weight of 27.6 kDa.
For the expression vector with a T7 lac promoter, final
IPTG concentration should be optimized because of its
great contribution to recombinant protein expression and
serious harm to cell growth. We investigated the effect of
IPTG at different concentrations on the K88-1NT and
F107-C fimbriae production. IPTG concentrations from
0.05 to 2 mM used to induce expression of K88-1NT and
F107-C subunits after 5 h. Comparison of intensity of the
bands in SDS-PAGE showed that 0.5 mM IPTG is suitable
for higher expression of K88-1NT subunit, while 0.75 mM
IPTG strongly stimulated expression of F107-C subunit.
After adding the IPTG into the medium, the target protein
begins to be synthesized and induction time is necessary
for recombinant protein production. In this work, the
optimal induction time for expression was examined by
analyzing samples taken in every 2 h, from 2 to 16 h, after
induction with 0.5 mM IPTG (K88-1NT) and 0.75 mM
IPTG (F107-C-PT2) at 25 C. The results showed that
highest expression of K88-1NT subunit occurred after 6 h
of induction, while that of F107-C subunit is after 14 h.

Kết quả (Việt) 1:

Tái tổ hợp vật nuôi 200/D-TOTO vector đã phải chịu đểtiêu hóa và Đảng Cộng sản Romania. SacI và SmaI đã được chọn cho analysisof faeG-1NT và fedA-C gen, tương ứng. Tiêu hóatái tổ hợp vectơ với SacI hoặc SmaI sản xuất hai linearizedNhững mảnh ADN 6.5 kb (faeG – 1NT) hoặc 6.2 kb(fedA-C), như dự kiến sẽ cho thấy rằng các gen đã thực sựchèn vào trong véc tơ. Đảng Cộng sản Romania phân tích cho thấy rằng genkhuếch đại với các kích thước dự kiến của 829 bp (faeG-1NT)và 516 bp (faeA-C).Biểu hiện của F107-C và K88-1NT fimbrial subunitsđã được thực hiện trong E. coli BL21 StarTM (DE3) ở 37 C trênLB vừa bổ sung với 1% glucose và 50 lg/mlKanamycin. Các nền văn hóa được thực hiện trên một xoayshaker với tốc độ 200 viên mỗi phút một OD600 0,8. Isopropylb-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) đã được thêm vào một trận chung kếtnồng độ của 0,5 mM cho cảm ứng. Một thời gian cảm ứngđã được kéo dài từ 2 đến 10 h, và các tế bào đã được thu hoạchbởi số tại 8.000 vòng/phút/4 C cho 1 phút. Đóng băngvà tan băng ở 42 C được thực hiện với ba lặp đi lặp lạiđể phá vỡ các tế bào và tái tổ hợp protein đã được phục hồi bởikhai thác đệm (50 mM K3PO4 pH 7.8, 400 mM NaCl,100 mM KCl, 10% glycerol và 0,5% Trixton X-100).Mức độ biểu hiện của fimbrial subunits đã được assayed bởiđiện trên 12% (w/v) polyacrylamide gel. Gelsau đó được nhuộm màu với Coomassie màu xanh R-250 và hình ảnhđược phân tích bởi một chất lượng phần mềm (ver 4.1, BioRad).Biểu hiện của gen faeG-1NT và fedA-C đãdự kiến sẽ sản xuất protein * 31 kDa (27 kDa K88 -Tiểu đơn vị 1NT và 3.7 kDa fusion mảnh của vật nuôi 200/DTOTOvector) và 22 kDa (18 kDa F07-C tiểu đơn vị và3.7 kDa fusion mảnh của vật nuôi 200/D-TOTO véc tơ). ChoCác phần bao gồm cơ thể, các ban nhạc mạnh mẽ của 22 và 31 kDađã thu được trong các nền văn hóa gây ra với IPTG (hình 1). ProteinBan nhạc của K88-1NT và F107-C subunits trong unsolublephân số là rất yếu (dữ liệu không hiển thị). Cho các uninducedtế bào, không có điểm thành protein dự kiến kích thước được quan sát thấy, gợi ýcảm ứng với IPTG là cần thiết cho các biểu hiện củafaeG-1NT và fedA-C tiểu đơn vị fimbrial gen.Imberechts et al. [10] cô lập tiểu đơn vị fimbrial lớn F107gen (fedA) từ căng thẳng bệnh phù nề 107/86 của E. coli. CácfedA gen trình tự, một mở đọc khung đó mãcho một protein với 170 axit amin, trong đó có một acid amin 21tín hiệu peptide, đã được tìm thấy. Protein mà không có tín hiệudãy (trưởng thành peptide) có một trọng lượng phân tử tính toáncủa thêm 16 kDa. Verdonck et al. [7] nhân bản F4 fimbrialadhesin FaeG monome từ E. coli căng thẳng GIS26 vàthể hiện trong E. coli BL21 (DE3) với trọng lượng phân tửkhoảng 32 kDa. Hồ et al. [9] bày tỏ extracellularly F4 fi-mbrial adhesin FaeG bởi tái tổ hợp Lactococcus lactis.Bên cạnh đó, hoàng et al. [17] thể hiện thành công FaeG, mộttiểu đơn vị chính của K88ad fimbriae trong thực vật biến đổi gen thuốc lávới trọng lượng phân tử 27,6 kDa.Cho các biểu hiện véc tơ với một promoter lạc T7, cuối cùngTập trung IPTG phải được tối ưu hóa vì của nóđóng góp lớn vào biểu hiện protein tái tổ hợp vàthiệt hại nghiêm trọng cho tăng trưởng tế bào. Chúng tôi điều tra tác động củaIPTG ở các nồng độ khác nhau trên K88-1NT vàSản xuất F107-C fimbriae. IPTG nồng độ từ0,05-2 mM được sử dụng để tạo ra các biểu hiện của K88-1NT vàF107-C subunits sau khi 5 h. so sánh của cường độ của cácBan nhạc dùng mũi SDS-trang cho thấy rằng 0,5 mM IPTG là phù hợpcho các biểu hiện cao của tiểu đơn vị K88-1NT, trong khi 0,75 mMIPTG mạnh mẽ kích thích biểu hiện của tiểu đơn vị F107-C.Sau khi thêm IPTG vào các phương tiện, protein mục tiêubắt đầu được tổng hợp và cảm ứng thời gian là cần thiếtcho sản xuất protein tái tổ hợp. Trong tác phẩm này, cácthời gian cảm ứng tối ưu cho các biểu hiện được kiểm tra bởiphân tích mẫu lấy trong mỗi 2giờ, từ 2 đến 16 h, sau khicảm ứng với 0,5 mM IPTG (K88-1NT) và 0,75 mMIPTG (F107-C-PT2) ở 25 C. Kết quả cho thấy rằngCác biểu hiện cao nhất của tiểu đơn vị K88-1NT xảy ra sau khi 6 hcảm ứng, trong khi đó của tiểu đơn vị F107-C là sau 14 h.

Kết quả (Việt) 2:

Tái tổ hợp pET 200 / D-TOTO vector đã phải chịu
tiêu hóa và PCR. SACI và SmaI đã được lựa chọn cho analysisof faeG-1NT và Feda-C gen tương ứng. Tiêu hóa của
vectơ tái tổ hợp với SACI hoặc SmaI sản xuất hai tuyến tính hóa
các mảnh ADN 6,5 kb (faeG-1NT) hoặc 6,2 kb
(Feda-C), như mong đợi chỉ ra rằng gene được thực sự
đưa vào trong các vector. Phân tích PCR cho thấy gene
khuếch đại với các kích thước dự kiến của 829 bp (faeG-1NT)
và 516 bp (faeA-C).
Biểu thức của F107-C và K88-1NT tiểu đơn vị cơ hội tồn tại
được thực hiện trong E. coli BL21 StarTM (DE3) tại 37 C vào
LB vừa bổ sung 1% glucose và 50 lg / ml
kanamycin. Các nền văn hóa đã được thực hiện trên một vòng quay
shaker với tốc độ 200 rpm đến một OD600 0,8. Isopropyl
BD-1-thiogalactopyranoside (IPTG) đã được thêm vào một thức
nồng độ 0,5 mM cho cảm ứng. Một thời gian cảm ứng
đã được mở rộng 2-10 h, và các tế bào được thu hoạch
bằng ly tâm ở 8000 rpm / 4 C trong 1 phút. Việc khoanh
và tan băng ở 42 C được thực hiện với ba lần lặp lại
để phá vỡ các tế bào và các protein tái tổ hợp đã được thu hồi bằng
đệm (50 mM K3PO4 pH 7.8, 400 mM NaCl,
100 mM KCl, 10% glycerol và 0,5% Trixton X-100).
mức độ biểu hiện của tiểu đơn vị cơ hội tồn tại được phân tích bằng
điện di trên 12% (w / v) polyacrylamide gel. Các gel
sau đó được nhuộm với Coomassie Xanh R-250 và hình ảnh
đã được phân tích bởi chất lượng Một phần mềm (ver 4.1, BioRad).
Biểu thức của các gen faeG-1NT và Feda-C đã được
dự kiến sẽ sản xuất protein của * 31 kDa (27 kDa K88 -
1NT tiểu đơn vị và 3,7 kDa fusion mảnh pET 200 / DTOTO
vector) và 22 kDa (18 kDa F07-C tiểu đơn vị và
3,7 kDa fusion mảnh pET 200 / D-TOTO vector). Đối với
sự bao gồm cơ thể phần, các ban nhạc mạnh mẽ của 22 và 31 kDa
đã thu được trong các nền văn hóa cảm ứng với IPTG (Fig. 1). Protein
ban nhạc của K88-1NT và F107-C tiểu đơn vị trong unsoluble
phân số rất yếu (dữ liệu không hiển thị). Đối với các uninduced
tế bào, không có ban nhạc protein có kích thước dự kiến sẽ được quan sát, gợi ý
rằng cảm ứng với IPTG là cần thiết cho sự biểu hiện của
faeG-1NT và Feda-C gen tiểu đơn vị cơ hội tồn tại.
Imberechts et al. [10] F107 cô lập chính tiểu đơn vị cơ hội tồn
gen (Feda) từ chủng bệnh phù nề 107/86 của E. coli. Các
gen Feda được giải trình tự, một khung đọc mở mã hóa
cho một protein có 170 axit amin, trong đó có 21 amino axit
tín hiệu peptide, đã được tìm thấy. Các protein mà không có tín hiệu
liên tục (peptide trưởng thành) có trọng lượng phân tử tính toán
của hơn 16 kDa. Verdonck et al. [7] nhân bản F4 hội tồn
adhesin FaeG monome từ E. coli chủng GIS26 và
thể hiện trong E. coli BL21 (DE3) với trọng lượng phân tử
khoảng 32 kDa. Hu et al. [9] bày tỏ extracellularly F4 fi-
mbrial adhesin FaeG bởi tái tổ hợp Lactococcus lactis.
Bên cạnh đó, Huang et al. [17] thể hiện thành công FaeG, một
tiểu đơn vị lớn của K88ad fimbriae trong cây thuốc lá chuyển gen
có khối lượng phân tử là 27,6 kDa.
Đối với các vector biểu hiện với một promoter T7 lac, thức
nồng độ IPTG nên được tối ưu hóa vì nó
góp phần quan trọng để biểu hiện protein tái tổ hợp và
tác hại nghiêm trọng đối với sự tăng trưởng của tế bào. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của
IPTG ở các nồng độ khác nhau trên K88-1NT và
F107-C fimbriae sản xuất. Nồng độ IPTG từ
0,05 đến 2 mM sử dụng để gây biểu hiện của K88-1NT và
F107-C tiểu đơn vị sau 5 h. So sánh cường độ của các
ban nhạc ở SDS-PAGE cho thấy 0,5 mM IPTG là thích hợp
cho biểu hiện cao hơn của K88-1NT tiểu đơn vị, trong khi 0,75 mM
IPTG mạnh kích thích biểu hiện của F107-C tiểu đơn vị.
Sau khi thêm các IPTG vào môi trường, các protein mục tiêu
bắt đầu được tổng hợp và thời gian cảm ứng là cần thiết
để sản xuất protein tái tổ hợp. Trong tác phẩm này,
thời gian cảm ứng tối ưu cho biểu đều được kiểm tra bởi
việc phân tích mẫu lấy trong mỗi 2 h, 2-16 h, sau khi
cảm ứng với 0,5 mM IPTG (K88-1NT) và 0,75 mM
IPTG (F107-C-pt2) tại 25 C. Kết quả cho thấy
biểu hiện cao nhất của K88-1NT tiểu đơn vị xảy ra sau 6 h
cảm ứng, trong khi đó F107-C tiểu đơn vị là sau 14 h.