Detection of DNA fragmentation by g

Detection of DNA fragmentation by gel electrophoresis. DNA fragmentation was determined using DNA ladder detec- tion kit (Invitrogen), following the manufacturer's instructions. Briefly, HT-29 cells were detached from the plates by scraping


and washed in PBS. Cells (2x106) were resuspended in 70 μl TE lysis buffer and the enzyme A solution provided in the kit was added to the crude lysate and incubated at 37˚C for 10 min. The resultant sample was then treated with enzyme B solution and incuba ted at 50˚C for 30 min. DNA was precipitated with ammonium acetate solution and pre-cooled absolute ethanol followed by centrifugation at 16,000 x g for
10 min. The DNA pellet was washed with 70% ethanol and re-centrifuged at 16,000 x g for 10 min. Precipitated DNA was resuspended in the provided DNA suspension buffer and analyzed after separation by gel electrophoresis (1.5% agarose). The DNA bands were examined using a Gel Docu- mentation System (BioRad, Model Gel Doc 2000, USA).

Measurement of mitochonrial membrane potential (Δ„m) by flow cytometry analysis with JC-1 staining. JC-1 is a cationic dye that exhibits potential mitochondria-dependent accumu- lation, indicated by a fluorescence emission shift from green to red, which thus can be used as an indicator of mito- chondrial potential. In this experiment, 1x106 treated HT-29 cells were resuspended after trypsinization in 1 ml of medium and incubated with 10 μg/ml of JC-1 (Invitrogen) at 37˚C, 5% CO2, for 30 min. Both red and green fluorescence emissions were analyzed by flow cytometry after JC-1 staining.

Analysis of caspase activation. The activities of caspase-3 and -9 were determined by a colorimetric assay using the caspase-3 and -9 activation kits (Invitrogen), following the manufacturer's instructions. Briefly, after treated with various concentrations of EEHDW for 24 h, HT-29 cells were lysed with provided lysis buffer for 30 min on ice. The lysed cells were centrifuged at 16,000 x g for 10 min, and 100 μg of the protein were incubated with 50 μl of the colorimetric tetra- peptides, Asp-Glu-Val-Asp (DEAD)-p-nitroaniline (pNA) (specific substrate of caspase-3) or Leu-Glu-His-Asp (LEHD)- pNA (specific substrate of caspase-9) at 37˚C in the dark for
2 h. Samples were read at 405 nm in an ELISA reader (BioTek, Model EXL800, USA). The data were normalized to the activity of the caspases in control cells (treated with
0.5% DMSO vehicle) and presented as fold of control.

RNA extraction and RT-PCR analysis. HT-29 cells (2x105) were seeded into 6-well plates in 2 ml medium and treated with various concentrations of EEHDW for 24 h. Total RNA from HT-29 cells was isolated with TRIzol reagent (Invitrogen). Oligo(dT)-primed RNA (1 μg) was reverse- transcribed with SuperScript II reverse transcriptase (Promega) according to the manufacturer's instructions. The obtained cDNA was used to determine the mRNA amount of Bcl-2 or Bax by PCR with Taq DNA polymerase (Fermentas). GAPDH was used as an internal control. The primers used for amplification of Bcl-2, Bax and GAPDH transcripts are as follows: Bcl-2 forward 5'-CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT-3 and reverse 5'-GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3'; Bax forward 5'-TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3' and reverse 5'-TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3'; GAPDH forward 5'-GT CAT CCA TGA CAA CTT TGG-3' and reverse 5'-GA GCT TGA CAA AGT GGT CGT-3'.

Kết quả (Việt) 1:

Phát hiện sự phân mảnh DNA của gel điện. Phân mảnh DNA đã được xác định bằng cách sử dụng ADN bậc thang detec-tion kit (Invitrogen), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn, tế bào HT-29 được cho tách ra từ các tấm bởi cào và rửa trong PBS. Tế bào (2 x 106) đã được resuspended trong 70 μl TE lysis đệm và enzym một giải pháp được cung cấp theo bộ đã được bổ sung để thô lysate và ủ tại 37˚C trong 10 phút. Kết quả mẫu sau đó được điều trị bằng enzym B giải pháp và ted incuba tại 50˚C cho 30 phút DNA được dự báo với amoni axetat giải pháp và trước khi làm mát bằng nước tuyệt đối ethanol theo sau là số 16.000 x g cho10 phút. Miếng DNA được rửa sạch với 70% ethanol và tái ly 16.000 x g cho 10 phút Precipitated DNA resuspended trong bộ đệm cung cấp hệ thống treo DNA và phân tích sau khi tách gel điện (1,5% agarose). Các ban nhạc DNA đã được kiểm tra bằng cách sử dụng một Gel tra - dùng hệ thống (BioRad, Model Gel Doc 2000, Hoa Kỳ).Đo lường của mitochonrial màng tiềm năng (Δ "m) bằng cách phân tích cytometry dòng với JC-1 nhuộm. JC-1 là một loại thuốc nhuộm cation trưng bày tiềm năng phụ thuộc vào ti thể accumu-lation, được chỉ định bởi một thay đổi phát thải huỳnh quang từ xanh sang màu đỏ, mà do đó có thể được sử dụng như là một chỉ báo của mito-chondrial tiềm năng. Trong thử nghiệm này, 1 x 106 được điều trị các tế bào HT-29 đã được resuspended sau khi trypsinization trong 1 ml của phương tiện và ủ với 10 μg/ml của JC-1 (Invitrogen) ở 37˚C, 5% CO2, trong 30 phút. Cả hai phát thải huỳnh quang màu đỏ và màu xanh lá cây được phân tích bởi cytometry dòng chảy sau khi JC-1 nhuộm.Phân tích của kích hoạt caspase. Các hoạt động của caspase-3 và -9 đã được xác định bởi một khảo nghiệm colorimetric bằng cách sử dụng caspase-3 và -9 kích hoạt kits (Invitrogen), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn, sau khi điều trị bằng các nồng độ khác nhau của EEHDW cho 24 h, HT-29 tế bào được phân với lysis cung cấp đệm trong 30 phút trên băng. Các tế bào phân được ly 16.000 x g cho 10 phút, và 100 μg của protein được ủ với 50 μl tetra-peptide colorimetric, Asp-Glu-Val-Asp (chết) - p - nitroaniline (pNA) (bề mặt cụ thể của caspase-3) hay Leu-Glu-của ông-Asp (LEHD)-pNA (bề mặt cụ thể của caspase-9) tại 37˚C trong bóng tối cho2 h. mẫu được đọc tại 405 nm trong một trình đọc ELISA (BioTek, mô hình EXL800, Hoa Kỳ). Dữ liệu được chuẩn hoá hoạt động của caspase trong tế bào kiểm soát (điều trị bằng0.5% DMSO xe) và trình bày như màn hình đầu tiên của kiểm soát.Khai thác RNA và phân tích RT-Đảng Cộng sản Romania. HT-29 tế bào (2 x 105) được hạt vào 6-cũng tấm ở 2 ml vừa và điều trị bằng các nồng độ khác nhau của EEHDW cho 24 h. tất cả RNA từ tế bào HT-29 đã được cô lập với TRIzol tinh khiết (Invitrogen). Oligo (dT)-sơn lót RNA (1 μg) là đảo ngược-phiên âm với SuperScript II reverse transcriptase (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. CDNA thu được được sử dụng để xác định số lượng mRNA Bcl-2 hoặc Bax Đảng Cộng sản Romania với Taq DNA polymerase (Fermentas). GAPDH đã được sử dụng như là một kiểm soát nội bộ. Các chất nền, mồi được sử dụng cho khuếch đại của bảng điểm Bcl-2, Bax và GAPDH như sau: Bcl-2 phía trước 5'-CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT-3 và ngược lại 5'-GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3'; Bax chuyển tiếp 5'-TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3' và đảo ngược 5'-TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3'; GAPDH chuyển tiếp 5'-GT CAT CCA TGA CAA CTT TGG-3' và đảo ngược 5'-GA GCT TGA CAA AGT GGT CGT-3'.

Kết quả (Việt) 2:

Phát hiện phân mảnh DNA bằng gel điện di. Phân mảnh DNA đã được xác định bằng hình thang DNA kit detec tion (Invitrogen), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn, HT-29 tế bào được tách ra từ các tấm bằng cách cạo và rửa trong PBS. Cells (2x106) đã lơ lửng trong 70 ml TE lysis đệm và các enzyme Một giải pháp được cung cấp trong bộ đã được thêm vào lysate thô và ủ ở 37C trong 10 phút. Các mẫu kết quả sau đó đã được điều trị bằng dung dịch enzyme B và incuba ted ở 50˚C trong 30 phút. DNA đã bị kết tủa với dung dịch ammonium acetate và ethanol tuyệt đối trước nguội sau ly tâm ở 16.000 xg cho 10 phút. Các viên DNA đã được rửa sạch với 70% ethanol và tái ly tâm ở 16.000 xg trong 10 phút. Tủa DNA đã được lơ lửng trong cung cấp DNA treo đệm và phân tích sau khi tách ra bằng gel electrophoresis (1,5% agarose). Các băng DNA đã được kiểm tra bằng cách sử dụng một hệ thống quá trình thực Gel văn kiện (BioRad, Model Gel Doc 2000, USA). Đo điện thế màng mitochonrial (Δ "m) bởi dòng cytometry phân tích với JC-1 nhuộm. JC-1 là một loại thuốc nhuộm cation rằng cuộc triển lãm tiềm năng lation accumu mitochondria phụ thuộc, được chỉ định bởi một sự thay đổi phát xạ huỳnh quang từ màu xanh sang màu đỏ, mà do đó có thể được sử dụng như một chỉ số về tiềm năng chondrial mito-. Trong thí nghiệm này, 1x106 điều trị HT-29 tế bào được lơ lửng sau khi trypsinization trong 1 ml vừa và ủ với 10 mg / ml của JC-1 (Invitrogen) tại 37C, 5% CO2, trong 30 phút. Cả hai phát huỳnh quang màu đỏ và màu xanh lá cây được phân tích bởi dòng cytometry sau JC-1 nhuộm. Phân tích kích hoạt caspase. Các hoạt động của caspase-3 và -9 được xác định bằng xét nghiệm đo màu bằng cách sử dụng bộ dụng cụ caspase-3 và -9 kích hoạt (Invitrogen), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn, sau khi xử lý với nồng độ khác nhau của EEHDW trong 24 h, HT-29 tế bào được ly giải với cung cấp đệm lysis trong 30 phút trên băng. Các tế bào ly giải được ly tâm ở 16.000 xg trong 10 phút, và 100 mg protein được ủ với 50 ml của các peptide tetra so màu, Asp-Glu-Val-Asp (DEAD) -p-nitroaniline (PNA) (chất nền cụ thể caspase-3) hoặc Leu-Glu-His-Asp (LEHD) - PNA (chất nền cụ thể của caspase-9) tại 37C trong bóng tối cho 2 h. Các mẫu được đọc ở 405 nm trong một trình đọc ELISA (Biotek, Model EXL800, USA). Các số liệu được chuẩn hóa đến hoạt động của các caspase trong các tế bào kiểm soát (điều trị bằng 0,5% DMSO xe) và trình bày như lần kiểm soát. Chiết RNA và phân tích RT-PCR. HT-29 tế bào (2x105) đã được gieo vào tấm 6-tốt trong môi 2 ml và điều trị với các nồng độ khác nhau của EEHDW trong 24 h. RNA tổng số từ HT-29 tế bào được phân lập với TRIzol thuốc thử (Invitrogen). Oligo (dT) RNA -primed (1 mg) là reverse- chép với superscript II sao chép ngược (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các cDNA thu được đã được sử dụng để xác định số lượng mRNA của Bcl-2 hoặc Bax bằng PCR với Taq DNA polymerase (Fermentas). GAPDH đã được sử dụng như là một kiểm soát nội bộ. Các mồi được sử dụng để khuếch đại của Bcl-2, Bax và GAPDH bảng điểm như sau: Bcl-2 mong 5'-CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT-3 và ngược 5'-GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3 '; Bax mong 5'-TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3 'và ngược 5'-TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3'; GAPDH mong 5'-GT CAT CCA TGA CAA CTT TGG-3 'và ngược 5'-GA GCT TGA CAA AGT GGT CGT-3'.