to the variance in total cell count

to the variance in total cell counts from the same core. As a com- parison, the variance in CARD-FISH counts using proteinase K to permeabilize archaea was very closely related (P 0.001, R2
0.80, n 10) to the variance in total cell counts with a fit line that was indistinguishable from a 1:1 line (slope 0.98 0.18, inter- cept 0.03 0.05; Fig. 4B).
This high variability of qPCR data is well within that expected from the variability of DNA extraction yields. Two commonly used kits, MoBio UltraClean and FastDNA Spin kits, had yields of DNA retrieved from a known quantity of cells added to sediments of 15% 16% and 28% 11%, respectively (40). This means that qPCR is not a reliable method to measure absolute quantities of cells in marine sediments, most likely due to variable extraction yields. However, for a given extraction, qPCR of 16S rRNA is quantitative relative to that of other genes, since the sum of bac- terial and archaeal 16S rRNA gene copy numbers closely matches the 16S rRNA gene copy numbers obtained using a primer set universal for all prokaryotes (P 0.001, R2 0.74, n 80; Fig.
4c). This suggests that, at least for these primers, measurements of extracted DNA are precise, if not accurate. Previous work agrees that although absolute quantities of qPCR measurements vary by extraction (35), relative values are repeatable across different primer sets (35) and cores (5, 29).
We did not systematically examine primer bias across all prim- ers because bias depends on how well a primer or TaqMan probe matches the in situ microbial community, which varies greatly across ecosystems. Also, unlike with FISH and CARD-FISH, re- searchers utilized a wide range of qPCR primers and probes, mak- ing spurious correlations likely for each small data set. However, ARCH516, which was developed to target hydrothermal vent ar- chaea (41), has previously been suggested to be biased against the type of archaea found in organic-rich marine sediments (12). Therefore, we tested whether this bias was borne out in the whole data set. We found that using ARCH516 as a qPCR primer or probe was associated with lower percentages of archaea (P
0.001, n 430; see Fig. S5A and Table S6 in the supplemental material). This bias was depth dependent; we found that the use of ARCH516 systematically resulted in low percentages of archaea at every depth except for the top centimeter, in which all qPCR prim- ers/probes resulted in low archaeal fractions (see Fig. S5B and Table S6 in the supplemental material). An exception that sup- ports the conclusion that the use of ARCH516 is inadequate for archaea in organic-rich sediments is that in the few studies of oligotrophic sediments available, the use of ARCH516 resulted in more archaea than bacteria (42, 43). This reflects the fact that the ARCH516 sequence is a good match to archaeal sequences re- trieved from oligotrophic deep-sea sediments (84 out of 85 ar- chaeal sequences in the Silva 111NR database from the South Pa- cific Gyre contained perfect matches to the ARCH516 sequence).
Using best-practice methods to examine changes in abun- dance of archaea and bacteria with depth in marine environ- ments. We conclude that the best practice to determine the abso- lute densities of viable bacteria and archaea in marine sediments is CARD-FISH using lysozyme and proteinase K to permeabilize bacteria and archaea, respectively. For seawater, FISH measure- ments are also acceptable. The best practice for qPCR is to report values relative to those for comeasured genes. For anoxic marine sediments, ARCH516 should be avoided, although other environ- ments will have different primer biases. These best-practice meth- ods provide initial answers to the two basic questions about bac-

teria and archaea in marine environments: what is their abundance, and what fraction is viable?
With CARD-FISH, bacterial cell densities decreased with depth in sediments and also below the euphotic zone in seawater (Fig. 5A and D). In sediments, we used qPCR measurements to estimate total bacteria by multiplying the best-practice qPCR frac- tion for bacteria by the total cell count for that sample and the median yield for best-practice method CARD-FISH (0.84). With this method, bacterial cell densities decreased with depth at a slope nearly identical to that for the CARD-FISH data. However, qPCR estimations were systematically higher than CARD-FISH mea- surements, suggesting that bacteria are overrepresented in qPCR measurements due to more efficient DNA extraction, better matches to primers, or higher 16S rRNA gene copy numbers than those for archaea. Unexpectedly, the trend of decreasing bacteria with depth in marine sediments ended at 10 mbsf; below this depth, bacterial cell density was not correlated with sediment depth. This may indicate the presence of a more stable deep sub- surface population that is better equipped for subsurface living.
Archaeal qPCR-estimated cell densities also decreased with depth in marine sediments and below the euphotic zone in seawa- ter (Fig. 5B and E), but this decrease was more gradual than that of bacteria, causing the ratio of archaea to bacteria to increase signif- icantly with depth in the upper 10 m of marine sediments and below the euphotic zone in seawater (Fig. 5C and F). The trend of increasing ratios of archaea to bacteria with depth was true within individual sediment cores as well (13/16 cores; the results for 6 were significant to a P value of 0.05). No core had a statistically significant decrease in the ratio of archaea to bacteria with depth. Increasing ratios of archaea to bacteria with depth have been well documented in seawater (44, 45), and we show that is upheld in both seawater and sediments when all published data are consid- ered together. Archaeal CARD-FISH counts increased slightly with depth (Fig. 5E); although the data coverage was low, the slope was barely significant, and the trend explains only 4% of the vari- ation. Low data coverage also makes it difficult to know if a more persistent population of archaea is found below 10 mbsf, similar to the findings for bacteria.
To answer the second question about cell viability in the ma- rine subsurface requires the assumption that cells or spores con- taining ribosomes, even at a very low concentration, are alive, although cells may not be very active relative to human timescales. The extremely slow biomass turnover in the deep subsurface makes it difficult to test this hypothesis (46), but the high chemical lability of RNA and its rapid degradation (47) make RNA a good candidate for an indicator of living biomass. In both seawater and sediments, the majority of cells producing DAPI, AO, or SYBR green signals also had positive CARD-FISH signals, showing that they contain ribosomes. If ribosome-free yet intact cells are pres- ent, they must therefore represent a minority of archaea and/or bacteria. This agrees with metatranscriptomic data (48) from Peru Margin sediments, showing that at all sediment depths assayed (down to 159 m) both bacteria and archaea contain mRNA.
Conclusions. The near absence of viable archaea in published CARD-FISH quantifications of the deep marine subsurface is likely to be an artifact of improper archaeal permeabilization pro- cedures and does not indicate archaeal inactivity or absence. qPCR measurements for deep subsurface sediments obtained us- ing ARCH516 as a primer or probe also systematically underesti- mate the fraction of archaea. These conclusions are supported by

Kết quả (Việt) 1:

để phương sai trong tất cả di động tính từ cùng một lõi. Như một com-parison, phương sai trong cá thẻ đếm sử dụng proteinase K để permeabilize vi khuẩn cổ rất chặt chẽ liên quan (P 0,001, R2 0,80, n 10) để phương sai trong đếm tất cả di động với một dòng phù hợp là không thể phân biệt từ một dòng 1:1 (độ dốc 0,98 0,18, inter-cept 0.03 0,05; Hình 4B).Này biến đổi cao của dữ liệu qPCR trong đó dự kiến sẽ từ sự biến đổi của DNA khai thác sản lượng. Hai thường sử dụng bộ dụng cụ, MoBio UltraClean và FastDNA quay bộ dụng cụ, có sản lượng của DNA Lấy từ một số lượng được biết đến của các tế bào được thêm vào các trầm tích của 15% 16% và 28% 11%, tương ứng (40). Điều này có nghĩa rằng qPCR không phải là một phương pháp đáng tin cậy để đo lường số lượng tuyệt đối của các tế bào trong các trầm tích biển, có nhiều khả năng do sản lượng biến khai thác. Tuy nhiên, đối với một khai thác cho trước, qPCR 16S rRNA là định lượng tương đối so với của gen khác, kể từ tổng bac-terial và vi khuẩn cổ 16S rRNA gene bản sao số chặt chẽ phù hợp với 16S rRNA gene bản sao số thu được bằng cách sử dụng một mồi thiết phổ quát cho tất cả sinh (P 0,001, R2 0,74, n 80; Hình.4 c). điều này cho thấy rằng, ít nhất các chất nền, mồi, đo đạc về chiết xuất DNA được chính xác, nếu không chính xác. Công việc trước đây đồng ý rằng mặc dù các số lượng tuyệt đối của qPCR đo khác nhau bằng cách khai thác (35), giá trị tương đối được lặp lại trên toàn bộ mồi khác nhau (35) và lõi (5, 29).Chúng ta đã làm không có hệ thống xem xét thiên vị mồi trên tất cả prim-ers vì thiên vị phụ thuộc vào tốt như thế nào một mồi hoặc TaqMan thăm dò phù hợp với cộng đồng vi sinh vật tại chỗ, thay đổi đáng kể trên hệ sinh thái. Ngoài ra, không giống như với cá và thẻ-cá, re-tìm kiếm sử dụng một loạt các qPCR chất nền, mồi và đầu dò, mak-ing giả mạo tương quan có khả năng cho mỗi tập hợp dữ liệu nhỏ. Tuy nhiên, ARCH516, được phát triển để mục tiêu thủy nhiệt vent ar-chaea (41), đã được đề nghị trước đó để được thiên vị chống lại loại vi khuẩn cổ được tìm thấy trong các trầm tích biển phong phú hữu cơ (12). Vì vậy, chúng tôi thử nghiệm cho dù xu hướng này mọc tập hợp dữ liệu toàn bộ. Chúng tôi thấy rằng bằng cách sử dụng ARCH516 như một qPCR mồi hoặc thăm dò đã được liên kết với tỷ lệ phần trăm thấp của vi khuẩn cổ (P 0,001, n 430; Xem hình. S5A và bảng S6 trong các vật liệu bổ sung). Xu hướng này là sâu phụ thuộc; chúng tôi thấy rằng việc sử dụng của ARCH516 có hệ thống kết quả trong tỷ lệ phần trăm thấp của vi khuẩn cổ ở mỗi sâu ngoại trừ cm hàng đầu, trong đó tất cả qPCR prim-ers/đầu dò dẫn đến phân số vi khuẩn cổ thấp (xem hình. S5B và bảng S6 trong các vật liệu bổ sung). Một ngoại lệ rằng sup-cổng kết luận rằng việc sử dụng của ARCH516 là không đủ cho vi khuẩn cổ trong các trầm tích giàu hữu cơ là trong vài nghiên cứu của oligotrophic trầm tích có sẵn, kết quả là việc sử dụng của ARCH516 ở vi khuẩn cổ thêm hơn vi khuẩn (42, 43). Điều này phản ánh thực tế rằng dãy ARCH516 là một trận đấu tốt để vi khuẩn cổ chuỗi re-trieved từ trầm tích biển sâu oligotrophic (84 trong số 85 ar-chaeal trình tự trong cơ sở dữ liệu 111NR Silva từ các Nam Pa - cific vòng quanh có hoàn hảo phù hợp với để dãy ARCH516).Bằng cách sử dụng phương pháp thực hành tốt nhất để kiểm tra những thay đổi trong abun-dance của vi khuẩn cổ và vi khuẩn với độ sâu biển environ-ments. Chúng tôi kết luận rằng các thực hành tốt nhất để xác định mật độ abso-đàn luýt khả thi vi khuẩn và vi khuẩn cổ trong các trầm tích biển là thẻ cá bằng cách sử dụng lysozyme và proteinase K permeabilize vi khuẩn và vi khuẩn cổ, tương ứng. Đối với nước biển, cá biện pháp-ments cũng là chấp nhận được. Các thực hành tốt nhất cho qPCR là báo cáo giá trị tương đối so với những người comeasured gen. Cho thiếu ôxy trầm tích biển, ARCH516 nên tránh, mặc dù khác environ-ments sẽ có biases mồi khác nhau. Các thực hành tốt nhất meth - ods cung cấp câu trả lời đầu tiên cho hai câu hỏi cơ bản về Bắc - Teria và vi khuẩn cổ trong môi trường biển: giàu có của họ là gì, và những gì phần là khả thi?Với thẻ-cá, tế bào vi khuẩn mật độ giảm với độ sâu trong các trầm tích và cũng dưới vùng euphotic trong nước biển (hình 5A và D). Trong các trầm tích, chúng tôi sử dụng qPCR đo để ước tính tất cả vi khuẩn bằng cách nhân thực hành tốt nhất qPCR frac-tion cho vi khuẩn đếm tổng số tế bào cho mẫu đó và năng suất trung bình đối với phương pháp thực hành tốt nhất thẻ cá (0,84). Với phương pháp này, các tế bào vi khuẩn mật độ giảm với độ sâu gần như giống hệt nhau để mà cho các dữ liệu thẻ-cá độ dốc. Tuy nhiên, qPCR estimations đã có hệ thống cao hơn thẻ cá mea-surements, gợi ý rằng vi khuẩn là overrepresented trong qPCR đo lường do hiệu quả hơn DNA khai thác, tốt hơn phù hợp với lớp lót, hoặc cao hơn 16S rRNA gene bản sao số hơn so với vi khuẩn cổ. Bất ngờ, xu hướng giảm dần các vi khuẩn với độ sâu trong các trầm tích biển kết thúc lúc 10 mbsf; dưới độ sâu này, mật độ tế bào vi khuẩn không phải tương quan với trầm tích sâu. Điều này có thể cho thấy sự hiện diện của một dân số sâu phụ bề mặt ổn định hơn trang bị tốt hơn cho cuộc sống bên dưới bề mặt.Vi khuẩn cổ qPCR ước tính di động mật độ cũng giảm với độ sâu trong các trầm tích biển và dưới vùng euphotic ở seawa-ter (hình 5B và E), nhưng giảm này là hơn dần dần hơn vi khuẩn, gây ra tỷ lệ vi khuẩn cổ với các vi khuẩn để tăng signif-icantly với độ sâu 10 m trên của trầm tích biển và dưới vùng euphotic trong nước biển (hình 5 c và F). Xu hướng tăng tỷ lệ của vi khuẩn cổ với các vi khuẩn với độ sâu là đúng sự thật trong lõi trầm tích cá nhân là tốt (13/16 lõi; các kết quả cho 6 đã được đáng kể giá trị P 0,05). Lõi không có ý nghĩa thống kê giảm tỷ lệ vi khuẩn cổ với vi khuẩn với độ sâu. Các tỷ lệ ngày càng tăng của vi khuẩn cổ với các vi khuẩn với độ sâu cũng đã được ghi nhận trong nước biển (44, 45), và chúng tôi cho rằng tôn trọng trong cả nước biển và các trầm tích khi tất cả các dữ liệu được xuất bản là consid-ered với nhau. Vi khuẩn cổ thẻ-cá tính tăng lên một chút với độ sâu (hình 5E); mặc dù vùng phủ sóng dữ liệu là thấp, dốc là hầu như không đáng kể, và xu hướng giải thích chỉ 4% vari-tin. Phạm vi bảo hiểm thấp dữ liệu cũng làm cho nó khó khăn để biết nếu một liên tục hơn dân số vi khuẩn cổ được tìm thấy dưới 10 mbsf, tương tự như những phát hiện cho vi khuẩn.Để trả lời thứ hai các câu hỏi về khả năng di động trong ma-rine dưới bề mặt đòi hỏi phải giả định rằng các tế bào hoặc bào tử con-taining ribosom, ngay cả ở một nồng độ rất thấp, đang sống, mặc dù các tế bào có thể không rất tích cực tương đối so với timescales của con người. Doanh thu nhiên liệu sinh học rất chậm trong sâu bên dưới bề mặt làm cho nó khó khăn để thử nghiệm giả thuyết này (46), nhưng lability hóa học cao của RNA và suy thoái nhanh chóng của nó (47) làm cho RNA một ứng cử viên tốt cho một chỉ báo của nhiên liệu sinh học cuộc sống. Ở cả hai nước biển và các trầm tích, phần lớn các tế bào sản xuất DAPI, AO, hoặc SYBR xanh tín hiệu cũng có tín hiệu thẻ cá tích cực, Đang hiển thị rằng họ chứa ribosome. Nếu ribosome miễn phí nhưng vẫn còn nguyên vẹn tế bào có pres-ent, họ do đó phải đại diện cho một thiểu số của vi khuẩn cổ và/hoặc vi khuẩn. Điều này đồng ý với metatranscriptomic dữ liệu (48) từ Peru Margin trầm tích, thấy rằng ở tất cả trầm tích sâu assayed (xuống đến 159 m) cả hai vi khuẩn và vi khuẩn cổ chứa mRNA.Kết luận. Gần vắng mặt của vi khuẩn cổ khả thi trong xuất bản thẻ cá quantifications của biển sâu bên dưới bề mặt có khả năng là một artifact của vi khuẩn cổ không đúng permeabilization pro-cedures và chỉ ra các vi khuẩn cổ không hoạt động hoặc vắng mặt. qPCR phép đo cho các trầm tích sâu dưới bề mặt thu được chúng tôi-ing ARCH516 như một mồi hoặc thăm dò cũng có hệ thống underesti-mate phần của vi khuẩn cổ. Những kết luận được hỗ trợ bởi

Kết quả (Việt) 2:

phương sai trong tổng số tế bào từ các lõi. Như một sự so sánh, phương sai trong CARD-FISH đếm sử dụng proteinase K để permeabilize khuẩn cổ có liên quan rất chặt chẽ (P 0,001, R2
0,80, n 10) đến sự khác biệt trong tổng số tế bào có một dòng phù hợp đó là không thể phân biệt từ một 1 :. 1 dòng (. dốc 0,98 0,18, liên khái 0,03 0,05; 4B hình)
biến cao này qPCR dữ liệu cũng là trong đó dự kiến từ sự thay đổi của sản lượng khai thác DNA. Hai bộ dụng cụ thường được sử dụng, MoBio UltraClean và FastDNA bộ dụng cụ Spin, có năng suất của DNA lấy từ một lượng đã biết của các tế bào thêm vào trầm tích của 15% 16% và 28% 11%, tương ứng (40). Điều này có nghĩa rằng qPCR không phải là một phương pháp đáng tin cậy để đo lường số lượng tuyệt đối của các tế bào trong trầm tích biển, có thể là do sản lượng khai thác biến. Tuy nhiên, đối với một khai thác được, qPCR 16S rRNA là định lượng tương đối của các gen khác, kể từ khi tổng của terial bac- và 16S rRNA số bản sao gen archaeal khớp với số bản sao gen 16S rRNA thu được bằng cách sử dụng một bộ mồi phổ quát cho tất cả prokaryote (P 0,001, R2 0.74, n 80;. Hình
4c). Điều này cho thấy, ít nhất là đối với các loại sơn lót, đo lường của DNA được chiết xuất là chính xác, nếu không chính xác. Nghiên cứu trước đây đồng ý rằng mặc dù số lượng tuyệt đối của phép đo qPCR khác nhau bằng cách chiết xuất (35), giá trị tương đối được lặp lại trên bộ khác nhau lót (35) và lõi (5, 29).
Chúng tôi không có hệ thống kiểm tra bias mồi trên tất cả các ers prim- vì thiên vị phụ thuộc vào như thế nào một mồi hoặc TaqMan thăm dò phù hợp trong cộng đồng vi khuẩn tại chỗ, trong đó thay đổi lớn trên các hệ sinh thái. Ngoài ra, không giống như với FISH và CARD-FISH, tìm kiếm lại sử dụng một loạt các đoạn mồi qPCR và đầu dò, mak- ing mối tương quan giả có khả năng cho mỗi bộ dữ liệu nhỏ. Tuy nhiên, ARCH516, được phát triển nhằm hướng thủy nhiệt trút chaea ar- (41), trước đây đã được đề nghị để được thiên vị chống lại các loại vi khuẩn cổ được tìm thấy trong trầm tích biển giàu hữu cơ (12). Do đó, chúng tôi đã kiểm tra liệu thiên vị này đã được sinh ra trong các bộ tập dữ liệu. Chúng tôi thấy rằng việc sử dụng ARCH516 như một mồi qPCR hoặc dò được gắn liền với tỷ lệ thấp hơn của vi khuẩn cổ (P
0,001, n 430; xem hình S5A và Bảng S6 trong vật liệu bổ sung.). Thiên vị này là phụ thuộc chiều sâu; chúng tôi thấy rằng việc sử dụng các hệ thống ARCH516 dẫn đến tỷ lệ thấp của vi khuẩn cổ ở mọi độ sâu trừ centimét hàng đầu, trong đó tất cả qPCR prim- ers / đầu dò dẫn đến phân số archaeal thấp (xem hình. S5B và Bảng S6 trong vật liệu bổ sung) . Một ngoại lệ là trợ giúp trong các cổng kết luận rằng việc sử dụng các ARCH516 là không đủ cho vi khuẩn cổ trong trầm tích giàu hữu cơ là trong một vài nghiên cứu trầm tích oligotrophic sẵn, việc sử dụng các ARCH516 dẫn đến vi khuẩn cổ hơn vi khuẩn (42, 43). Điều này phản ánh một thực tế rằng các trình tự ARCH516 là một trận đấu tốt để chuỗi archaeal tái trieved từ trầm tích biển sâu oligotrophic (84 trong số 85 chuỗi chaeal ar- trong cơ sở dữ liệu Silva 111NR từ Nam nhân cific Gyre chứa các trận đấu hoàn hảo để các ARCH516 trình tự).
Sử dụng phương pháp thực hành tốt nhất để kiểm tra những thay đổi trong vũ abun- của vi khuẩn cổ và vi khuẩn có chiều sâu trong điều kiện môi trường biển. Chúng tôi kết luận rằng việc thực hành tốt nhất để xác định mật độ đàn luýt abso- của vi khuẩn hữu hiệu và vi khuẩn cổ trong trầm tích biển là CARD-FISH sử dụng lysozyme và proteinase K để vi khuẩn và vi khuẩn cổ permeabilize, tương ứng. Đối với nước biển, FISH phép đo cũng được chấp nhận. Các thực hành tốt nhất cho qPCR là báo cáo giá trị so với các gen comeasured. Đối với trầm tích biển thiếu ôxy, ARCH516 nên tránh, mặc dù điều kiện môi trường khác sẽ có các định kiến mồi khác nhau. Các phương thực hành tốt nhất meth- cung cấp câu trả lời ban đầu với hai câu hỏi cơ bản về bac- tiêu chuẩn về vi khuẩn cổ và trong môi trường biển: sự phong phú của họ là gì, và những gì phần là khả thi với CARD-FISH, mật độ tế bào vi khuẩn giảm theo độ sâu trong trầm tích và cũng dưới vùng euphotic trong nước biển (Hình 5A. và D). Trong các trầm tích, chúng tôi sử dụng các phép đo qPCR để ước lượng tổng số vi khuẩn bằng cách nhân các thực hành tốt nhất qPCR phần nhỏ cho vi khuẩn bằng tổng số tế bào cho mẫu và sản lượng trung bình của phương pháp thực hành tốt nhất-CARD-FISH (0.84). Với phương pháp này, mật độ tế bào vi khuẩn giảm theo chiều sâu ở một độ dốc gần giống như đối với các dữ liệu CARD-FISH. Tuy nhiên, ước tính đã có hệ thống qPCR cao hơn CARD-FISH phép đo, cho thấy rằng vi khuẩn tồn tại rất nhiều trong các phép đo qPCR do khai thác hiệu quả hơn DNA, các trận đấu tốt hơn để mồi, hoặc 16S rRNA số bản sao gen cao hơn so với vi khuẩn cổ. Thật bất ngờ, xu hướng giảm vi khuẩn có chiều sâu trong trầm tích biển kết thúc vào lúc 10 mbsf; dưới độ sâu này, mật độ tế bào vi khuẩn được không tương quan với độ sâu phù sa. Điều này có thể chỉ ra sự hiện diện của một số sâu bề mặt tiểu ổn định hơn được trang bị tốt hơn cho cuộc sống dưới mặt đất. archaea qPCR-ước tính mật độ tế bào cũng giảm theo độ sâu trong trầm tích biển và dưới vùng euphotic trong ter seawa- (Fig. 5B và E ), nhưng giảm này đã được nhiều dần so với vi khuẩn, gây ra tỷ lệ vi khuẩn cổ vi khuẩn để tăng signif- icantly với độ sâu ở phía trên bên 10 m của trầm tích biển và dưới vùng euphotic trong nước biển (Hình. 5C và F). Xu hướng tăng tỷ lệ vi khuẩn cổ vi khuẩn với độ sâu là sự thật trong lõi trầm tích cá nhân cũng như (13/16 lõi, kết quả cho 6 là có ý nghĩa với một giá trị P 0,05). Không cốt lõi đã giảm đáng kể về mặt thống kê ở các tỷ lệ vi khuẩn cổ để vi khuẩn có chiều sâu. Tăng tỷ lệ vi khuẩn cổ vi khuẩn với độ sâu đã được ghi nhận trong nước biển (44, 45), và chúng tôi thấy đó được phê chuẩn trong cả nước biển và trầm tích khi tất cả các dữ liệu được công bố là xem xét việc này lại với nhau. Đếm CARD-FISH archaea tăng nhẹ với độ sâu (Hình 5E.); mặc dù vùng phủ sóng dữ liệu thấp, độ dốc là hầu như không đáng kể, và xu hướng giải thích chỉ có 4% của ation vari. Phủ sóng dữ liệu thấp cũng làm cho nó khó khăn để biết nếu một dân dai dẳng của vi khuẩn cổ được tìm thấy dưới 10 mbsf, tương tự như các kết quả nghiên cứu cho vi khuẩn. Để trả lời câu hỏi thứ hai về khả năng di động trong Rine ngầm ma- đòi hỏi giả định rằng các tế bào hoặc bào tử ribosome taining dựng, thậm chí ở nồng độ rất thấp, còn sống, mặc dù các tế bào có thể không được rất tích cực so với khoảng thời gian của con người. Doanh thu sinh khối rất chậm dưới bề mặt sâu làm cho nó khó khăn để kiểm tra giả thuyết này (46), nhưng lability hóa cao của RNA và suy thoái nhanh chóng của nó (47) làm cho RNA một ứng cử viên tốt cho một chỉ số về sinh khối sống. Trong cả hai nước biển và trầm tích, phần lớn các tế bào sản xuất DAPI, AO, hoặc SYBR tín hiệu màu xanh lá cây cũng đã tích cực tín hiệu CARD-FISH, cho thấy chúng chứa ribosome. Nếu các tế bào nguyên vẹn chưa ribosome miễn là ent áp lực, do đó họ phải đại diện cho một thiểu số của vi khuẩn cổ và / hoặc vi khuẩn. Điều này phù hợp với dữ liệu metatranscriptomic (48) từ Peru Margin trầm tích, cho thấy ở tất cả các độ sâu trầm tích khảo nghiệm (xuống 159 m) cả vi khuẩn và vi khuẩn cổ chứa mRNA. Kết luận. Sự vắng mặt của vi khuẩn cổ gần khả thi trong công bố quantifications CARD-FISH của lớp dưới bề mặt biển nước sâu có khả năng là một tạo tác của permeabilization archaeal cedures trình không đúng cách và không chỉ ra không hoạt động archaeal hoặc vắng mặt. đo qPCR cho trầm tích bên dưới mặt đất sâu được chúng tôi- ing ARCH516 như một mồi hoặc thăm dò cũng người bạn đời có hệ thống underesti- phần của vi khuẩn cổ. Những kết luận này được hỗ trợ bởi