Analysis of CRISPR/Cas9-mediated ge

Analysis of CRISPR/Cas9-mediated genome editing during HSV-1 latently
gRNA target sites were amplified from gRNA-expressing quiescent MRC5 cells using the following gene-specific primers: UL8-fw 5’-TAGAAATCCCGCAGCTCCGTC-3’, UL8-rev 5’-GGGGCGGTGAACTTTAGCAC-3’, UL29-fw 5’-GAGGGCGTCAGTTTCAGGGAC-3’, UL29-rev 5’-GATTCATTCCCCAACCCCGGTC-3’, UL52-fw 5’-GCGCGGATCATCTCATATTGTTCC-3’ and UL52–rev 5’- GACGAACATGGGTCGGGTTC-3’. Derived amplicons were isolated from 2% agarose gels by gel extraction (GeneJET PCR Purification Kit, ThermoFisher Scientific) and subjected to a second PCR reaction to increase product yield and add sequence tags (lower case sequence) for subsequent barcoding and Illumina adapter introduction: UL8_flank_fw 5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGGCGTTGCGACATACAAAATAC-3’, UL8_flank_rev 5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTATAAGTCTCGGGACCGCACTC-3’, UL29_flank_fw 5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGTGCGAGAACCCACGACCAC-3’, UL29_flank_rev 5’- gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagCTCGGGAGACATACCTTGTCG-3’, UL52_flank_fw -tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagTCTCATATTGTTCCTCGGGGCG-3’ and UL52_flank_rev 5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTCTTCGAACCTGTCTTGCTCCG-3’. Expand High Fidelity PCR system (Roche) was used for all PCR reactions according to manufacturer’s instructions.
Amplified DNA was isolated from 2% agarose gels (GeneJET PCR Purification Kit, ThermoFisher Scientific), barcoded and prepared for Illumina MiSeq sequencing using the 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation kit (Illumina). DNA concentrations were determined by the Qubit fluorometer 2.0 (Life Technologies, USA) with the Qubit dsDNA High Specificity assay kit. DNA libraries were sequenced by Illumina MiSeq (250bp paired-end). Obtained sequences were quality-checked with FASTQC v0.11.3 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and trimmed with seqtk version 1.0-r31. Sequences were aligned to the viral reference sequences by using Bowtie2 version 2.2.6 [90] using the sensitive-local alignment mode. Alignments were converted to bam format and indexed with samtools version 1.3 [91] and analyzed in Tablet version 1.14.04.10 [92] for CRISPR/Cas9 specific indels at the gRNA target site.
Supporting Information
S1 Fig.EPS

Kết quả (Việt) 1:

Phân tích về bộ gen CRISPR/Cas9-trung gian chỉnh sửa trong HSV-1 latentlygRNA mục tiêu trang web đã được khuếch đại từ thể hiện gRNA quiescent MRC5 tế bào bằng cách sử dụng lớp lót gen cụ thể sau đây: UL8-fw 5'-TAGAAATCCCGCAGCTCCGTC-3', UL8-rev 5'-GGGGCGGTGAACTTTAGCAC-3', UL29-fw 5'-GAGGGCGTCAGTTTCAGGGAC-3', UL29-rev 5'-GATTCATTCCCCAACCCCGGTC-3', UL52-fw 5'-GCGCGGATCATCTCATATTGTTCC-3 'và UL52-rev 5'-GACGAACATGGGTCGGGTTC-3'. Có nguồn gốc amplicons bị cô lập từ 2% gel agarose bằng gel chiết (GeneJET PCR làm sạch Kit, ThermoFisher khoa học) và phải chịu một phản ứng PCR thứ hai để tăng sản lượng sản phẩm và thêm chuỗi tags (trường hợp thấp hơn trình tự) tiếp theo barcoding và Illumina adapter giới thiệu: UL8_flank_fw 5 '- tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGGCGTTGCGACATACAAAATAC - 3', UL8_flank_rev 5' - gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTATAAGTCTCGGGACCGCACTC - 3', UL29_flank_fw 5 '- tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGTGCGAGAACCCACGACCAC - 3', UL29_flank_rev 5' - gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagCTCGGGAGACATACCTTGTCG - 3', UL52_flank_fw - tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagTCTCATATTGTTCCTCGGGGCG-3' và UL52_flank_rev 5' - gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTCTTCGAACCTGTCTTGCTCCG - 3'. Mở rộng độ trung thực cao PCR (Roche) hệ thống đã được sử dụng cho tất cả các phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Khuếch đại ADN bị cô lập từ 2% agarose gel (GeneJET PCR làm sạch Kit, khoa học ThermoFisher), barcoded và chuẩn bị cho Illumina MiSeq xác định trình tự bằng cách sử dụng những 16 Metagenomic trình tự chuẩn bị thư viện kit (Illumina). Nồng độ DNA đã được xác định bởi Qubit fluorometer 2.0 (công nghệ cuộc sống, USA) với Qubit dsDNA đặc trưng cao khảo nghiệm kit. Thư viện DNA được trình tự của Illumina MiSeq (250bp kết nối-kết thúc). Cảnh thu được đã được kiểm tra chất lượng với FASTQC v0.11.3 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) và tỉa với seqtk Phiên bản 1,0-r31. Trình tự đã được liên kết đến trình tự tài liệu tham khảo do virus bằng cách sử dụng Bowtie2 Phiên bản 2.2.6 [90] bằng cách sử dụng các chế độ nhạy cảm-local alignment. Sự sắp xếp đã được chuyển đổi sang định dạng bam và lập chỉ mục với samtools Phiên bản 1.3 [91] và phân tích trong Tablet phiên bản 1.14.04.10 [92] cho CRISPR/Cas9 indels cụ thể tại các trang web mục tiêu gRNA.Thông tin hỗ trợS1 Fig.EPS

Kết quả (Việt) 2:

Phân tích CRISPR chỉnh sửa gen / Cas9 qua trung gian trong HSV-1 tiềm tàng
các trang web mục tiêu gRNA được khuếch đại từ gRNA-hiện tế bào MRC5 tĩnh bằng cách sử dụng mồi gen cụ thể sau đây: UL8-fw 5'-TAGAAATCCCGCAGCTCCGTC-3 ', UL8-rev 5' -GGGGCGGTGAACTTTAGCAC-3 ', UL29-fw 5'-GAGGGCGTCAGTTTCAGGGAC-3', UL29-rev 5'-GATTCATTCCCCAACCCCGGTC-3 ', UL52-fw 5'-GCGCGGATCATCTCATATTGTTCC-3' và UL52-rev 5'- GACGAACATGGGTCGGGTTC-3 '. Amplicon nguồn gốc được phân lập từ 2% gel agarose bằng cách chiết xuất gel (GeneJET PCR Purification Kit, ThermoFisher khoa học) và bị một phản ứng PCR thứ hai để tăng năng suất sản phẩm và thêm thẻ chuỗi (chuỗi chữ thường) cho mã vạch tiếp theo và Illumina giới thiệu adapter: UL8_flank_fw 5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGGCGTTGCGACATACAAAATAC-3 ', 5'-UL8_flank_rev gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTATAAGTCTCGGGACCGCACTC-3', 5'-UL29_flank_fw tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagGTGCGAGAACCCACGACCAC-3 ', 5'- UL29_flank_rev gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagCTCGGGAGACATACCTTGTCG-3', UL52_flank_fw -tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagTCTCATATTGTTCCTCGGGGCG-3 'và UL52_flank_rev 5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagTCTTCGAACCTGTCTTGCTCCG-3' . Mở rộng hệ thống PCR High Fidelity (Roche) đã được sử dụng cho tất cả các phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Amplified DNA được phân lập từ 2% gel agarose (GeneJET PCR Purification Kit, ThermoFisher khoa học), mã số sọc vằn và chuẩn bị cho Illumina MiSeq trình tự sử dụng các trình tự gen 16S metagenomic kit Chuẩn bị thư viện (Illumina). Nồng độ DNA được xác định bởi các qubit fluorometer 2.0 (Life Technologies, Mỹ) với bộ kit xét nghiệm qubit dsDNA cao đặc. Thư viện DNA đã được lập trình tự của Illumina MiSeq (250bp cặp-end). Trình tự thu được được chất lượng kiểm tra với FASTQC v0.11.3 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) và tỉa với phiên bản 1.0 seqtk-R31. Trình tự đã được liên kết với các đoạn tài liệu tham khảo của virus bằng cách sử dụng Bowtie2 phiên bản 2.2.6 [90] bằng cách sử dụng chế độ chỉnh nhạy cảm địa phương. Sự sắp xếp đã được chuyển đổi sang định dạng bam và lập chỉ mục với samtools phiên bản 1.3 [91] và phân tích phiên bản Tablet 1.14.04.10 [92] cho CRISPR / Cas9 indels cụ thể tại trang web mục tiêu gRNA.
Hỗ trợ thông tin
Fig.EPS S1