This approach of heterologous expre

This approach of heterologous expression of cloned
cytochrome P450 genes and functional testing of the
expressed enzymes resulted in the identification of the
taxoid 2-, 5-, 7
-, 10
-, 13- and 14
-hydroxylases
(Figure 4). All of the isolated sequences were very similar
to each other, but more distantly related to other
cytochrome P450 genes. The hydroxylation steps of taxol biosynthesis can be
divided into early, intermediate and late reactions. In
microsomal fractions of T. cuspidata, six hydroxylations
to taxadien-hexaol occurred under standard assay
conditions (Wheeler et al., 2001). The first reaction is the
conversion of taxa-4(5),11(12)-diene to 5-hydroxy-taxa-4(20),11(12)-diene (Hefner et al., 1996). A cDNA encoding the corresponding taxoid 5-hydroxylase was isolated
by homology and heterologous expression showed that
the cytochrome P450 enzyme utilized taxa-4(5),11(12)-diene as well as taxa-4(20),11(12)-diene as substrates
(Jennewein et al., 2004a). The catalytic mechanism
involves an unusual allylic transposition of the 4,5- or
4,20-double bond to a delocalized radical intermediate,
followed by hydroxylation at C5 and formation of the
4,20-double bond. Like many other early intermediates,
the 5-hydroxylated taxadiene is found only in trace
amounts in Taxus extracts (Ketchum and Croteau, 2006;
Hefner et al., 1996). The compound is likely to be
converted rapidly by the subsequent hydroxylases and
acyltransferases. The next modifications are probably
C13 and C10 hydroxylations. The cDNA clones of the
taxoid 10
- and 13-hydroxylases were isolated by
differential display (Schoendorf et al., 2001; Jennewein et
al., 2001) and the corresponding enzymes were shown to
use both 5-hydroxy-taxadiene and 5-acetoxy-taxadiene but with opposite substrate selectivities.
Although 5-hydroxy-taxadiene and 5-acetoxy-taxadiene are substrates for both enzymes, the former is
favored for 13-hydroxylation whereas the later is more
likely to be modified at C10. Together with results from
cell feeding studies using the relevant intermediates
(Ketchum and Croteau, 2006), it is likely that a bifurcation
occurs early in the taxol biosynthesis pathway, one
branch leads to taxol and the other to alternative taxoids
(or perhaps to taxol via a different route). Isolation of a
clone encoding taxoid 14
-hydroxylase by screening
transformed yeast cells containing P450 candidates
(Jennewein et al., 2003) supports the hypothesis of
diversification at this early stage. The enzyme converts
5-acetylated derivatives to 14
-hydroxylated taxadienes,
demonstrating the importance of acyltransfer reactions,
such as acetylation at C5 (Walker et al., 1999), for the
ultimate distribution of taxoid products. 14
-hydroxylated
compounds, e.g. taxuyunnamine C, are prominent
compounds isolated from Taxus cell cultures, which is
consistent with the abundance of the corresponding
cDNA clones in the induced Taxus cDNA library
(Jennewein et al., 2004b). This early branch point has
been the subject of intensive studies. Feeding
experiments in Taxus cell cultures with the radio-labeled
substrates taxa-4(5),11(12)-diene, 5-hydroxy-taxa-4(20),11(12)-diene, 5, 10
-dihydroxy-taxa-4(20),11(12)-diene, 5-acetoxy-taxa-4(20),11(12)-diene and 5-acetoxy-10
-hydroxytaxa-4(20),11(12)-diene clearly
showed the influence of acetylation at C5 on the
conversion to C14 taxoids (distribution of C13:C14 was
47:33 with 5-acetoxy-taxa-4(20),11(12)-diene). How-ever, hydroxylation at C10 directed the flux to C13
taxanes (75% C13 taxanes) (Ketchum et al., 2007).
C9-hydroxylation is also thought to be an early reaction
in the pathway. In vivo studies in which yeast were fed
5-hydroxy-taxadiene showed that one cDNA encoding a P450 candidate might represent a taxoid 9-hydroxylase,
but the product has yet to be confirmed by NMR (Croteau
et al., 2006)

Kết quả (Việt) 1:

Cách tiếp cận này heterologous biểu hiện của nhân bảncytochrome P450 gen và chức năng kiểm tra của cácbày tỏ enzym dẫn đến việc xác định cáctaxoid 2-, 5-, 7-, 10-, 13 - và 14 - hydroxylases(Hình 4). Tất cả các trình tự cô lập là rất tương tự như để mỗi khác, nhưng nhiều hơn xa liên quan kháccytochrome P450 gen. Các bước hydroxylation của taxol sinh tổng hợp có thểchia thành phản ứng đầu, Trung cấp và cuối. Ởmicrosomal các phần phân đoạn của T. cuspidata, sáu hydroxylationsđể taxadien-hexaol xảy ra dưới tiêu chuẩn khảo nghiệmđiều kiện (Wheeler và ctv., 2001). Phản ứng đầu tiên là cácchuyển đổi đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene 5-hydroxy-đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene (Hefner và ctv., 1996). Một cDNA mã hóa taxoid 5 - prolyl tương ứng bị cô lậpbởi tính tương đồng và heterologous biểu hiện đã chỉ ra rằngcytochrome P450 enzyme sử dụng đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene cũng là đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene như là chất nền(Jennewein et al., 2004a). Cơ chế tác dụng xúc tácliên quan đến một transposition allylic bất thường của 4,5 - hoặc4,20-kép trái phiếu để một cực đoan Trung Phi cục bộ,tiếp theo là hydroxylation tại C5 và hình thành của cáctrái phiếu 4,20-kép. Giống như nhiều khác trung gian đầu,taxadiene epoxit 5 được tìm thấy chỉ trong dấu vếtsố tiền trong Taxus chất chiết xuất (Ketchum và Croteau, năm 2006;Hefner et al., 1996). Các hợp chất có khả năng làchuyển đổi nhanh chóng của các hydroxylases tiếp theo vàacyltransferases. Những sửa đổi tiếp theo có thểC13 và C10 hydroxylations. CDNA bắt chước của cáctaxoid 10 - và 13 - hydroxylases đã được cô lập bởikhác biệt giữa màn hình (Schoendorf et al., năm 2001; Jennewein etAl, 2001) và các enzym tương ứng được hiển thị đểsử dụng cả hai 5 - hydroxy-taxadiene và 5 - acetoxy-taxadiene nhưng với selectivities bề mặt đối diện.Mặc dù 5 - hydroxy-taxadiene và 5 - acetoxy-taxadiene là chất nền cho cả hai enzyme, các cựu làủng hộ cho 13-hydroxylation trong khi sau này là thêmcó khả năng được thay đổi tại C10. Cùng với các kết quả từtế bào cho ăn nghiên cứu sử dụng các trung gian có liên quan(Ketchum và Croteau, 2006), nó có khả năng mà phân nhánh mộtxảy ra sớm trong chu trình sinh tổng hợp taxol, mộtchi nhánh dẫn đến taxol và khác để thay thế taxoids(hoặc có lẽ để taxol thông qua một con đường khác nhau). Sự cô lập của mộtsao chép mã hóa taxoid 14 - prolyl bằng cách kiểm trachuyển đổi tế bào nấm men có chứa P450 ứng cử viên(Jennewein và ctv., 2003) hỗ trợ giả thuyết củađa dạng hóa ở giai đoạn này. Chuyển đổi enzym5 - dẫn xuất acetylated để 14 - epoxit taxadienes,chứng tỏ tầm quan trọng của các phản ứng acyltransfer,chẳng hạn như acetylation tại C5 (Walker et al., 1999), cho cáccuối cùng phân phối sản phẩm taxoid. 14 - epoxitCác hợp chất, ví dụ như taxuyunnamine C, là nổi bậthợp chất cô lập từ Taxus nền văn hóa tế bào, đó làphù hợp với sự phong phú của các tương ứngcDNA bắt chước trong thư viện gây ra cDNA Taxus(Jennewein et al., 2004b). Thời điểm chi nhánh đầu này cótrở thành chủ đề của các nghiên cứu chuyên sâu. Cho ănCác thí nghiệm trong nền văn hóa tế bào Taxus với các đài phát thanh có nhãnchất nền đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene, 5 - hydroxy-đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene, 5, 10 - dihydroxy-đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene, 5 - acetoxy-đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene và 5 - acetoxy-10 - hydroxytaxa-4 (20), 11 (12)-diene rõ ràngcho thấy ảnh hưởng của acetylation tại C5 trên cácchuyển đổi để C14 taxoids (phân phối C13:C14 là47:33 với 5 - acetoxy-taxa-4(20),11(12)-diene). Làm thế nào-bao giờ hết, hydroxylation tại C10 đạo diễn tuôn ra để C13taxanes (75% C13 taxanes) (Ketchum và ctv., 2007). C9-hydroxylation cũng được cho là một phản ứng đầutrong con đường. Các nghiên cứu tại vivo trong nấm men mà được cho ăn5 - hydroxy-taxadiene cho thấy rằng một cDNA mã hóa một ứng cử viên P450 có thể đại diện cho một taxoid 9 - prolyl,nhưng các sản phẩm vẫn chưa được xác nhận bởi NMR (Croteauet al., 2006)

Kết quả (Việt) 2:

Cách tiếp cận này biểu hiện dị của nhân bản vô tính
gen cytochrome P450 và thử nghiệm chức năng của
enzyme thể hiện dẫn đến việc xác định các
taxoid 2 - 5 - 7 - 10 - 13 -? Và 14 -hydroxylases
(Hình 4). Tất cả các trình tự cô lập là rất giống
nhau, nhưng xa hơn liên quan đến các
gen cytochrome P450. Các bước hydroxyl hóa sinh tổng hợp taxol có thể được
chia thành các phản ứng đầu, trung cấp và muộn. Trong
các phân số microsome của T. cuspidata, sáu hydroxylations
để taxadien-hexaol xảy ra dưới khảo nghiệm tiêu chuẩn
điều kiện (Wheeler et al., 2001). Phản ứng đầu tiên là
chuyển đổi các đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -diene 5? -hydroxy-Loài-4 (20), 11 (12) -diene (Hefner et al., 1996). Một cDNA mã hóa các taxoid tương ứng 5? -hydroxylase Được phân lập
bởi tương đồng và dị loại biểu hiện cho thấy
các enzyme cytochrome P450 sử dụng đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -diene cũng như đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12 ) -diene làm chất nền
(Jennewein et al., 2004a). Cơ chế xúc tác
liên quan đến một allylic chuyển vị khác thường của 4,5- hoặc
trái phiếu 4,20-double với một gốc trung gian, delocalized
tiếp theo là hydroxyl hóa ở C5 và hình thành của
trái phiếu 4,20-double. Giống như nhiều trung gian sớm khác,
các taxadiene 5-hydroxy hóa chỉ được tìm thấy trong dấu vết
số tiền trong Taxus chiết xuất (Ketchum và Croteau, 2006;
Hefner et al., 1996). Các hợp chất có khả năng được
chuyển đổi nhanh chóng bởi các hydroxylases tiếp theo và
acyltransferases. Các thay đổi tiếp theo có thể là
C13 và C10 hydroxylations. Những bản sao cDNA
của? Taxoid 10 - và 13 -hydroxylases đã bị cô lập bởi
màn hình hiển thị khác biệt (. Schoendorf et al 2001,; Jennewein et
al., 2001) và các enzyme tương ứng được hiển thị
để? Sử dụng cả 5 -hydroxy-taxadiene và 5? -acetoxy-taxadiene nhưng với selectivities chất nền đối diện.
Mặc dù 5? -hydroxy-taxadiene và 5? -acetoxy-taxadiene là chất nền cho cả hai enzym, các cựu được
ưa chuộng cho 13-hydroxy trong khi sau này là nhiều
khả năng sẽ được sửa đổi tại C10. Cùng với những kết quả từ
nghiên cứu nuôi dưỡng tế bào sử dụng các chất trung gian có liên quan
(Ketchum và Croteau, 2006), có khả năng là một phân nhánh
xảy ra sớm ở con đường taxol sinh tổng hợp, một
nhánh dẫn đến taxol và khác với taxoids thay thế
(hoặc có lẽ để taxol qua một tuyến đường khác nhau). Phân lập một
mã hóa nhân bản taxoid 14? -hydroxylase Bằng cách sàng lọc
các tế bào nấm men chuyển hóa có chứa các ứng cử viên P450
(Jennewein et al., 2003) ủng hộ giả thuyết của
đa dạng hóa ở giai đoạn này. Các enzyme chuyển đổi
5? -acetylated Dẫn xuất đến 14? -hydroxylated Taxadienes,
chứng minh tầm quan trọng của acyltransfer phản ứng,
chẳng hạn như acetyl hóa ở C5 (Walker et al., 1999), cho
phân phối cuối cùng của sản phẩm taxoid. 14? -hydroxylated
Hợp chất, ví dụ như taxuyunnamine C, được nổi bật
các hợp chất cô lập từ Taxus nuôi cấy tế bào, đó là
phù hợp với sự phong phú của các ứng
nhái cDNA trong thư viện cDNA Taxus gây ra
(Jennewein et al., 2004b). Điểm chi nhánh đầu tiên này đã
là chủ đề của các nghiên cứu chuyên sâu. Ăn
thí nghiệm trong nuôi cấy tế bào Taxus với các đài phát thanh-dán nhãn
chất taxa-4 (5), 11 (12) -diene, 5? -hydroxy-Loài-4 (20), 11 (12) -diene, 5?,? 10? -dihydroxy-Loài-4 (20), 11 (12) -diene, 5? -acetoxy-Loài-4 (20), 11 (12) -diene và 5? -acetoxy-10? -hydroxytaxa-4 ( 20), 11 (12) -diene rõ ràng
cho thấy sự ảnh hưởng của acetyl hóa ở C5 trên các
chuyển đổi để C14 taxoids (phân phối của C13: C14
là? 47:33 với 5 -acetoxy-loài-4 (20), 11 (12) -diene). Làm thế nào-bao giờ hết, hydroxyl hóa ở C10 chỉ đạo thông đến C13
taxanes (75% taxanes C13) (Ketchum et al., 2007).
C9-hydroxyl cũng được cho là một phản ứng đầu
trong con đường. Trong các nghiên cứu in vivo trong đó men được cho ăn
5? -hydroxy-Taxadiene cho thấy một cDNA mã hóa một ứng cử viên P450 có thể đại diện cho một taxoid 9? -hydroxylase,
Nhưng sản phẩm vẫn chưa được xác nhận bởi NMR (Croteau
et al., 2006)