Materials and methods2.1. Ethics st

Materials and methods

2.1. Ethics statement

This study was conducted according to the principles expressed in the Declaration of Helsinki, and was approved by the ethical review boards of the Hospital for Tropical Diseases (HTD), Chil- dren’s Hospital 1 (CH1) and Children’s Hospital 2 (CH2) in Ho Chi Minh City in Viet Nam, and the Oxford Tropical Research Ethics Committee (OxTREC) in the United Kingdom. An informed consent form, signed by a parent or guardian, was required for participation.

2.2. Stool samples and sample processing

Stool samples were obtained from a group of symptomatic children (with diarrhea) and a group of asymptomatic children (without diarrhea). The symptomatic group consisted of 217 chil- dren, aged between 0 and 60 months, admitted to CH1, CH2 or HTD between May 2009 and April 2010 with acute watery diarrhea (defined as three or more loose stools without blood within a 24 h period). The asymptomatic group consisted of 277 children, aged between 0 and 60, attending CH2 for health checks between May
2009 and April 2010 without diarrhea. Stool specimens were col- lected from all participants within 24 h of hospital admission and
prior to antimicrobial treatment. All samples were stored at 4 ◦C
before transportation to the laboratory on the same day as collec- tion. Samples were assayed to detect RoV and NoV using ProspecT Rotavirus and IDEIA Norovirus EIA tests following manufacturer’s recommendations (Oxoid, United Kingdom). Two aliquots of each
sample were stored at −80 ◦C as 10% suspensions in distilled phos-
phate buffered saline (PBS).

2.3. Equine arterititis virus (EAV)

EAV was added to all samples prior to nucleic acid extraction as an internal control (Hue et al., 2011). Aliquots of post culturing supernatant containing EAV were prepared as described previously (Hue et al., 2011; Scheltinga et al., 2005). The precise amount of

virus added to the stool samples was assessed by PCR titration. The final EAV dilution used in the PCR assay produced Cp values between 30 and 33. Amplification runs that did not produce a Cp value within this range for EAV were discarded and samples were subjected to a secondary extraction and amplification.


2.4. NoV and RoV PCR amplification primers and probes

Primers, probes and their optimal concentrations are described in Table 1. Briefly, the RoV primers targeted the gene encoding non-structural protein 3 (NSP3) (Freeman et al., 2008), and the probe incorporated a FAM reporter and a BHQ1 quencher. The NoV primers and probes targeted the ORF1-ORF2 junction of NoV I and NoVII (Trujillo et al., 2006). The reporter of the NoVII probe was adapted from the probe published in Trujillo et al. (2006) from Quasar 670 (red) to Cyan 500 (blue–green) as these probes have a higher performance using the LightCycler format and as a conse- quence of the Cy5 tag of the internal control. The primers and probe for EAV were as previously described (Hue et al., 2011; Scheltinga et al., 2005).


2.5. Nucleic acid extractions and one-step RT Real-time PCR

Nucleic acid was extracted from bacterial and viral sources using the Wizard Nucleic Acid Purification Kit (Promega, USA) and the QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, USA), respectively. Nucleic acid preparations were diluted to a concentration of 20 ng/ l, and
stored at −20 ◦C. For viral RNA extractions from stool, 140 l of stool
was inoculated with 20 l of EAV and subjected to an automated
extraction on a MagNA Pure 96 nucleic extraction system using the MagNA Pure 96 DNA and the Viral NA Small Volume Kit (Roche applied sciences, UK), according to the manufacturers recommen- dations. PCR amplifications were performed using RNA Master Hydrolysis Probes (Roche applied sciences, UK), and optimized with
1.4 l of activator on a LightCycler 480II (Roche applied sciences, UK). Thermal cycling was initiated at 61 ◦C for 3 min for reverse
transcription; plates were cooled on ice for 2 min, and amplified

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp 2.1. Đạo đức báo cáo nghiên cứu này được tiến hành theo các nguyên tắc thể hiện trong Tuyên ngôn Helsinki, và đã được phê duyệt bởi Hội đồng xét đạo đức của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới (HTD), Bệnh viện 1 con cái của (CH1) và Bệnh viện Nhi Đồng 2 (CH 2) tại thành phố Hồ Chí Minh tại Việt Nam, và nhiệt đới Ban Oxford nghiên cứu Đạo đức (OxTREC) ở Vương quốc Anh. Một hình thức có sự đồng ý, có chữ ký của cha mẹ hoặc người giám hộ, đã được yêu cầu để tham gia. 2.2. Mẫu phân và xử lý mẫu mẫu phân thu được từ một nhóm trẻ em có triệu chứng (tiêu chảy) và một nhóm trẻ em có triệu chứng (không có tiêu chảy). Các nhóm triệu chứng gồm 217 con cái, ở độ tuổi từ 0 đến 60 tháng, nhập CH1, CH2 hoặc HTD giữa tháng năm 2009 và tháng 4 năm 2010 với tiêu chảy cấp tính (de định nghĩa là ba hoặc lỏng hơn phân không có máu trong một khoảng thời gian 24 h) . Các nhóm không có triệu chứng gồm 277 trẻ em có độ tuổi từ 0 đến 60, tham dự CH2 kiểm tra sức khỏe giữa tháng năm 2009 và tháng 4 năm 2010 mà không bị tiêu chảy. Mẫu phân đã được đồng nghiệp lected từ tất cả những người tham gia trong vòng 24 h nhập viện và trước khi điều trị kháng sinh. Tất cả các mẫu được lưu trữ ở 4 ◦C trước khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên cùng một ngày như gom. Các mẫu đã được kiểm định để phát hiện và RoV Nov sử dụng Prospect Rotavirus và Norovirus IDEIA EIA kiểm tra sau khuyến nghị của nhà sản xuất (Oxoid, Vương quốc Anh). Hai phân ước của mỗi mẫu được lưu trữ ở -80 ◦C là 10% bị đình chỉ trong chưng cất, phospho phate đệm mặn (PBS). 2.3. Ngựa rút arterititis (EAV) EAV được thêm vào tất cả các mẫu trước khi khai thác axit nucleic như một kiểm soát nội bộ (Huế et al., 2011). Dung dòch bưu nuôi nổi chứa EAV đã được chuẩn bị như mô tả trước đây (Huế et al 2011,;. Scheltinga et al, 2005.). Số lượng chính xác của vi rút thêm vào mẫu phân được đánh giá bằng cách chuẩn độ PCR. Các fi nal pha loãng EAV được sử dụng trong các xét nghiệm PCR tạo giá trị Cp giữa 30 và 33. Ampli fi cation chạy mà không tạo ra một giá trị Cp trong phạm vi này cho EAV đã được loại bỏ và các mẫu đã phải chịu một chiết trung và ampli fi cation. 2.4. Nov và RoV PCR ampli fi mồi cation và đầu dò mồi, thăm dò và nồng độ tối ưu của họ được mô tả trong Bảng 1. Brie fl y, mồi RoV nhắm mục tiêu các gen mã hóa protein không cấu trúc 3 (NSP3) (Freeman et al., 2008), và thăm dò kết hợp một phóng viên FAM và một BHQ1 thức uống. Các mồi Nov và đầu dò mục tiêu ngã ba ORF1-ORF2 của NOV tôi và Novii (Trujillo et al., 2006). Các phóng viên của tàu thăm dò Novii được chuyển thể từ thăm dò được công bố tại Trujillo et al. (2006) từ Quasar 670 (màu đỏ) để Cyan 500 (màu xanh-màu xanh lá cây) như các đầu dò có một hiệu suất cao hơn bằng cách sử dụng định dạng LightCycler và như là một dãy quả của các tag Cy5 của kiểm soát nội bộ. Các mồi và thăm dò EAV được mô tả như trước đây (Huế et al 2011,;. Scheltinga et al, 2005.). 2.5. Chiết axit nucleic và một bước RT Real-time PCR Nucleic Acid được chiết xuất từ các nguồn vi khuẩn và virus, sử dụng Wizard Nucleic Acid Puri fi cation Kit (Promega, USA) và Kit QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, USA), tương ứng. Axit nucleic được pha loãng với nồng độ 20 ng / l, và được lưu trữ ở -20 ◦C. Đối với việc nhổ RNA của virus từ các phân, 140 l phân được tiêm với 20 l của EAV và bị một tự động khai thác trên một tinh khiết 96 hệ thống khai thác nucleic Magna sử dụng Magna tinh khiết 96 DNA và Viral NA Khối lượng nhỏ Kit (Roche áp dụng khoa học, Vương quốc Anh), theo nghị của nhà sản xuất khuyến. PCR cation fi ampli đã được thực hiện bằng cách sử dụng RNA tổng thể thủy phân Probes (Roche áp dụng khoa học, Vương quốc Anh), và tối ưu hóa với 1,4 l của activator trên LightCycler 480II (Roche áp dụng khoa học, Anh). Đi xe đạp nhiệt đã được bắt đầu tại 61 ◦C 3 phút cho reverse transcription; tấm được làm lạnh trên băng trong 2 phút, và ampli fi ed