PHuntington’s disease is an autosom

PHuntington’s disease is an autosomal dominant, progressive neurodegenerative disorder involving the premature loss of specific neurons. It is associated with an expansion of a CAG trinucleotide repeat in the 5′ region of the huntingtin gene (HTT) which results in a lengthened polyglutamine tract of the protein. The CAG repeat number is polymorphic, ranging from 6 to 35 units in normal alleles and from 36 to 120 units in alleles associated with Huntington’s disease. The 12.8-kb HTT transcript of Göttingen minipigs codes for a 345-kDa protein (3,139 amino acids) [33]. The 8.2-kb transgene used for DNA microinjection into minipig embryos consisted of the 4-kb rat neuronspecific enolase (Nse) promoter, a 3.3-kb 5 ′ minipig huntingtin cDNA which was mutated by insertion of 75 CAG repeats into the triplet region of exon 1, and a 0.9-kb SV40 polyadenylation signal. Five transgenic founder pigs were produced each harboring one to three different integration sites with variable copy numbers and indication of genetic mosaicism [34]. To date, no follow-up publication describing mutant phenotypes appeared.
656 J Mol Med (2010) 88:653–664
Retinitis pigmentosa (RP) typically causes night blindness early in life due to loss of rod photoreceptors. The remaining cone photoreceptors slowly degenerate leading ultimately to blindness. Various genes and loci are associated with the
disease. Both transgenic and knockout rodent models of retinal dystrophy contributed to the analysis of the disease. Compared to humans, rodent models are limited by two disadvantages, the small number and different distribution of
neopromoter coding sequence Expressing transgenic pigs
Selectable expression vector
Transfection
Selection Embryo transfer
Nuclear transfer I
Nuclear transfer II
Establishment of cell culturesEmbryo transfer
Fetuses or offspring
Screening (integration, expression)
Fig. 2 Efficient production of transgenic pigs by using somatic cell nuclear transfer. An expression vector carrying a removable selection cassette is transfected into nuclear donor cells. After selection, the resulting transgenic cells are pooled and used for nuclear transfer. Pooling of cell colonies reduces the time in culture and allows the generation of independent founder fetuses/offspring in one litter. Cloned embryos are transferred to synchronized recipients. Depending
on the expected onset and tissue specificity of transgene expression, pregnancies may be terminated to recover fetuses, or birth and early development of offspring is awaited. Fetuses or tissues from born offspring are processed for transgene integration and expression studies, while individual cell cultures are established for re-cloning of the fetuses/offspring with the most suitable integration/expression pattern
Table 1 Transgenic pigs as disease models
Human disease Transgene expression References
Alzheimer’s disease Expression of mutant human APPsw in the brain Kragh PM et al. 2009 [32] Huntington’s disease Transgenic animals with mutant pig HTT Uchida M et al. 2001 [34] Retinitis pigmentosa Retinal expression of mutant pig RHOP347L or RHOP347S Petters RM et al. 1997, Kraft TW et al. 2005 [36, 37] Cardiovascular disease Endothelial over-expression of pig eNOS Hao YH et al. 2006 [40] Cystic fibrosis CFTR knockout or mutant pig CFTRdeltaF508 knockin Rogers CS et al. 2008 [28, 44] Type 2 diabetes mellitus Beta-cell expression of mutant dominant-negative human GIPRdn Renner S et al. 2010 [56] Type 3 of maturity-onset diabetes of the young Beta-cell expression of mutant dominant-negative human HNF1AP291fsinsC Umeyama K et al. 2009 [59]
J Mol Med (2010) 88:653–664 657
photoreceptors in the retina and the small eyes [35]. Therefore, transgenic pigs expressing a mutant porcine rhodopsin (RHO; P347L or P347S) were produced by additive gene transfer. A 12.5-kb porcine genomic DNA containing 4-kb 5′ flanking sequences, the coding sequences for the 348 amino acid protein and 2.9-kb 3′ flanking sequences of the porcine RHO gene was used for the introductionofthemutationCCA(Pro)→CTA(Leu)orTCA (Ser) in codon 347. DNA microinjection of the expression vectors for mutant rhodopsin resulted in the generation of transgenic lines. Retinal RNA expression of the mutant transgene exceeded the expression of the wild-type endogenous gene. Like human patients with the same mutation, the transgenic pigs showed early and severe loss of rod photoreceptors, and the surviving cone photoreceptors slowly degenerated. The phenotypes of mutant RHO transgenic pigs and of RP patients are comparable. Therefore, this novel animal model is intensely used for studying the pathogenesis of retinitis pigmentosa as well as for preclinical treatment trials [36, 37]. Furthermore, production of a transgenic pig model for spinal muscular atrophy, an autosomal recessive disorder characterized by the degeneration of motor neurons of the spinal cord leading to muscle atrophy, has been announced [38].
Cardiovascular diseases
Endothelial cell nitric oxide synthase (eNOS) regulates vascular function by releasing nitric oxide [39]. Transgenic pigs were produced for the analysis of the cardiovascular regulation by eNOS. The 7.3 kb transgene consisted of the 3.6-kb Yucatan pig eNOS cDNA and a V5 epitope and polyhistidine tag (V5-His tag) to discriminate between endogenous and transgenic eNOS that was cloned between the 2-kb TIE2 promoter and 1.7-kb TIE2 intron/enhancer elements for the endothelial cell-specific expression. The transgene was used for co-electroporation with a neomycin resistance gene expression cassette into Yucatan pig fetal fibroblasts for additive gene transfer. Four cloned transgenic pigs derived by SCNTof transgene-positive cells expressed the fusion protein which was localized to the endothelial cells of placental vasculature from the conceptuses as did the endogenous eNOS. The predicted size of the recombinant eNOS (1,242 amino acids) was 138 kDa, compared to 133 kDa of endogenous eNOS (1,205 amino acids). Localization of endogenous and transgenic eNOS revealed the expression in the endothelium. The transgenic pigs are further used to analyze the function of eNOS in regulating muscle metabolism and in the cardiorespiratory system [40]. In addition, a complementary knockout model of eNOS has been announced [41].
Cystic fibrosis
Alterations of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (1,480 amino acids) were identified to cause the autosomal recessive cystic fibrosis which still remains incurable. Mice with a disrupted Cftr gene failed to develop the lung and pancreatic disease causing most of the morbidity and mortality in human patients [42]. Porcine lungs share many anatomical, histological, biochemical, and physiological features with human lungs [43]. Mutant pigs were produced using SCNT and fetal fibroblasts with the CFTR gene either disrupted or containing the most common cystic fibrosis-associated mutation (deltaF508). Therefore, recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors were used to target CFTR in male fetal fibroblasts ofoutbreddomesticpigs.The4.5-kbknockoutgeneconstruct disrupted exon 10 encoding a portion of nucleotide-binding domain1withastopcodonatposition508(F508X)followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, whereas the deltaF508 knockin gene construct harbors the three nt deletion in exon 10 leading to deltaF508 followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the PGK promoter in the downstream intronic region. Using successfully targeted cells without viral vector sequences for SCNT, heterozygous mutant male piglets were generated with each mutation [28, 44]. Newborn piglets with a targeted disruption of both CFTR alleles exhibited similar defects as seen in newborn human patients, i.e., meconium ileus, exocrine pancreatic destruction, and focal biliary cirrhosis. Thus, the novel disease models may improve the analysis of the pathogenesis as well as the development of treatment strategies for cystic fibrosis [28, 44]. In addition, preliminary conference reports announced the production of transgenic pigs for the suppression of CFTR expression by RNA interference.
Diabetes mellitus
Rodent models for diabetes mellitus have been developed by the structural and/or functional modification of candidate genes [45] or by random mutagenesis programs [46]. Transgenic pigs were recently established as large animal models. In the context of type 2 diabetes mellitus, a chronic metabolic disorder of multiple etiologies characterized by uncontrolled hyperglycemia caused by both insulin resistance and progressive pancreatic beta-cell dysfunction [47], the two incretin hormones glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) attracted particular attention. GIP and GLP-1 are secreted by enteroendocrine cells in response to nutrients like fat and glucose and enhance glucose-induced insulin secretion [48]. In type 2 diabetic patients, the insulinotropic action of GIP is

Kết quả (Việt) 1:

PHuntington của bệnh là một rối loạn neurodegenerative tiến bộ, chi phối NST thường liên quan đến sớm rụng của tế bào thần kinh cụ thể. Nó được kết hợp với một sự mở rộng của một trinucleotide CAG lặp lại trong vùng 5 ' gen huntingtin (HTT) mà kết quả trong một đường kéo dài polyglutamine của protein. CAG lặp lại số là bướu, khác nhau, từ 6 cho các đơn vị 35 trong allele bình thường và từ 36 đến 120 đơn vị trong alen liên kết với bệnh Huntington. Bảng điểm HTT 12.8-kb của Göttingen minipigs mã cho một protein 345-kDa (3.139 axit amin) [33]. 8.2-kb transgene được sử dụng cho DNA microinjection thành minipig phôi bao gồm 4-kb rat neuronspecific ôxy (Nse) promoter, một 3.3-kb 5 ′ minipig huntingtin cDNA mà đột biến bởi chèn của 75 CAG lặp đi lặp lại vào vùng bộ ba của exon 1, và một tín hiệu polyadenylation 0.9-kb SV40. Năm người sáng lập biến đổi gen con lợn đã được sản xuất mỗi chứa chấp một đến ba khác nhau tích hợp các trang web bản sao biến số và dấu hiệu của di truyền mosaicism [34]. Đến nay, không có xuất bản tiếp theo mô tả đột biến phenotypes xuất hiện.656 J Mol Med (2010) 88:653-664Retinitis pigmentosa (RP) thường gây ra đêm mù sớm trong cuộc sống do mất của rod photoreceptors. Nón photoreceptors còn lại từ từ làm suy thoái dẫn cuối cùng đến mù. Các gen khác nhau và các loci có liên kết với cácbệnh. Cả hai biến đổi gen và loại trực tiếp các mô hình động vật gặm nhấm võng mạc loạn dưỡng đã đóng góp cho các phân tích của bệnh. So với con người, động vật gặm nhấm mô hình được giới hạn bởi hai nhược điểm, số lượng nhỏ và phân bố khác nhauneopromoter mã hóa trình tự Expressing biến đổi gen lợnLựa chọn biểu hiện vectorTransfectionLựa chọn chuyển phôiHạt nhân chuyển tôiHạt nhân chuyển IIThành lập các tế bào culturesEmbryo chuyểnBào thai hoặc con cáiKiểm tra (tích hợp, biểu hiện)Hình 2 hiệu quả sản xuất của các con lợn biến đổi gen bằng cách sử dụng chuyển giao hạt nhân tế bào Soma. Một véc tơ biểu hiện mang theo một cassette ổ lựa chọn transfected vào các nhà tài trợ hạt nhân tế bào. Sau khi lựa chọn, các tế bào kết quả biến đổi gen được gộp lại và được sử dụng để chuyển giao hạt nhân. Tổng hợp của thuộc địa di động làm giảm thời gian trong văn hóa và cho phép các thế hệ của người sáng lập ra độc lập bào thai/con cái trong một xả rác. Nhân bản phôi được chuyển giao cho người nhận được đồng bộ hóa. Tùy thuộcngày dự kiến khởi phát và mô đặc trưng của transgene biểu hiện, mang thai có thể được chấm dứt để phục hồi bào thai hoặc sinh và giai đoạn phát triển của con cái chờ đợi. Bào thai hoặc mô từ con cái sinh được thực hiện cho transgene tích hợp và biểu hiện nghiên cứu, trong khi nền văn hóa cá nhân tế bào được thành lập cho tái nhân bản của bào thai/con cái với các mô hình tích hợp/cụm từ thích hợp nhấtBảng 1 biến đổi gen con lợn là mô hình bệnhNgười bệnh Transgene biểu hiện tài liệu tham khảoBiểu hiện của bệnh Alzheimer của đột biến con người APPsw trong não Kragh PM et al. năm 2009 [32] Huntington bệnh động vật biến đổi gen với đột biến lợn HTT Uchida M et al. năm 2001 [34] Retinitis pigmentosa võng mạc biểu hiện của đột biến lợn RHOP347L hoặc RHOP347S Petters RM et al. 1997, Kraft TW et al. 2005 [36, 37] bệnh tim mạch nội mô hơn-biểu hiện của lợn eNOS Hao YH et al. 2006 [40] xơ nang CFTR loại trực tiếp hoặc đột biến lợn CFTRdeltaF508 knockin Rogers CS et al. 2008 [28 44] loại 2 bệnh tiểu đường tế bào Beta biểu hiện của đột biến âm chiếm ưu thế của con người GIPRdn Renner S et al. 2010 [56] loại 3 bệnh tiểu đường khởi đầu sự trưởng thành của biểu thức tế bào Beta trẻ của đột biến âm chiếm ưu thế của con người HNF1AP291fsinsC Umeyama K et al. 2009 [59]J Mol Med (2010) 88:653-664 657photoreceptors trong võng mạc và đôi mắt nhỏ [35]. Do đó, biến đổi gen con lợn thể hiện một đột biến rhodopsin porcine (RHO; P347L hoặc P347S) được sản xuất bởi phụ gia gen chuyển. Một 12,5-kb porcine gen DNA có 5 ' 4-kb sườn trình tự, các trình tự mã hóa cho các axit amin protein 348 và 3 ' 2,9-kb sườn trình tự của porcine RHO gene được sử dụng cho introductionofthemutationCCA (Pro) →CTA (Leu) orTCA (Ser) ở codon 347. DNA microinjection của vectơ biểu hiện cho đột biến rhodopsin kết quả trong thế hệ của biến đổi gen dòng. Võng mạc RNA biểu hiện của đột biến transgene vượt quá sự biểu hiện của gen nội sinh loại hoang. Giống như các bệnh nhân của con người với cùng một đột biến, cho thấy những con lợn biến đổi gen đầu và nghiêm trọng mất que photoreceptors, và nón photoreceptors còn sống sót từ từ thoái hóa. Phenotypes của đột biến RHO biến đổi gen lợn và bệnh nhân RP được so sánh. Do đó, mô hình động vật cuốn tiểu thuyết này mạnh mẽ được sử dụng để nghiên cứu bệnh sinh của retinitis pigmentosa là tốt đối với thử nghiệm preclinical điều trị [36, 37]. Hơn nữa, sản xuất của một mô hình biến đổi gen lợn cho cột sống cơ bắp Teo, một rối loạn lặn NST thường đặc trưng bởi sự thoái hóa tế bào thần kinh cơ của tủy dẫn đến cơ Teo, đã là công bố [38].Bệnh tim mạchTế bào nội mô nitric oxide synthase (eNOS) quy định chức năng mạch máu bằng cách giải phóng nitric oxide [39]. Lợn biến đổi gen đã được sản xuất cho các phân tích của các quy định tim mạch eNOS. 7.3 kb transgene bao gồm 3,6-kb Yucatan lợn eNOS cDNA và một V5 epitope và polyhistidine thẻ (V5 His thẻ) để phân biệt đối xử giữa eNOS nội sinh và biến đổi gen đã được nhân bản giữa 2-kb TIE2 promoter và 1,7-kb TIE2 intron/enhancer yếu tố cho các biểu hiện cụ thể tế bào nội mô. Transgene được sử dụng co-electroporation với một sức đề kháng neomycin biểu hiện gen cassette vào Yucatan lợn thai fibroblasts cho phụ gia gen chuyển. Bốn con lợn biến đổi gen nhân bản của SCNTof transgene-tích cực tế bào thể hiện phản ứng tổng hợp protein mà được bản địa hoá đến các tế bào nội mô của nhau thai mạch máu từ các conceptuses như đã làm eNOS nội sinh. Cỡ tái tổ hợp eNOS (1.242 axit amin), dự đoán là kDa 138, so với 133 kDa nội sinh eNOS (1.205 axit amin). Bản địa hóa nội sinh và biến đổi gen eNOS tiết lộ những biểu hiện trong nội mạc. Những con lợn biến đổi gen tiếp tục được sử dụng để phân tích các chức năng của eNOS trong việc điều chỉnh sự trao đổi chất cơ bắp và trong hệ thống cardiorespiratory [40]. Ngoài ra, một mô hình bổ sung vòng đấu loại trực của eNOS đã là công bố [41].Xơ nangAlterations of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (1,480 amino acids) were identified to cause the autosomal recessive cystic fibrosis which still remains incurable. Mice with a disrupted Cftr gene failed to develop the lung and pancreatic disease causing most of the morbidity and mortality in human patients [42]. Porcine lungs share many anatomical, histological, biochemical, and physiological features with human lungs [43]. Mutant pigs were produced using SCNT and fetal fibroblasts with the CFTR gene either disrupted or containing the most common cystic fibrosis-associated mutation (deltaF508). Therefore, recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors were used to target CFTR in male fetal fibroblasts ofoutbreddomesticpigs.The4.5-kbknockoutgeneconstruct disrupted exon 10 encoding a portion of nucleotide-binding domain1withastopcodonatposition508(F508X)followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, whereas the deltaF508 knockin gene construct harbors the three nt deletion in exon 10 leading to deltaF508 followed by a floxed neomycin resistance gene driven by the PGK promoter in the downstream intronic region. Using successfully targeted cells without viral vector sequences for SCNT, heterozygous mutant male piglets were generated with each mutation [28, 44]. Newborn piglets with a targeted disruption of both CFTR alleles exhibited similar defects as seen in newborn human patients, i.e., meconium ileus, exocrine pancreatic destruction, and focal biliary cirrhosis. Thus, the novel disease models may improve the analysis of the pathogenesis as well as the development of treatment strategies for cystic fibrosis [28, 44]. In addition, preliminary conference reports announced the production of transgenic pigs for the suppression of CFTR expression by RNA interference.Diabetes mellitusRodent models for diabetes mellitus have been developed by the structural and/or functional modification of candidate genes [45] or by random mutagenesis programs [46]. Transgenic pigs were recently established as large animal models. In the context of type 2 diabetes mellitus, a chronic metabolic disorder of multiple etiologies characterized by uncontrolled hyperglycemia caused by both insulin resistance and progressive pancreatic beta-cell dysfunction [47], the two incretin hormones glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) attracted particular attention. GIP and GLP-1 are secreted by enteroendocrine cells in response to nutrients like fat and glucose and enhance glucose-induced insulin secretion [48]. In type 2 diabetic patients, the insulinotropic action of GIP is