2,3-Butanediol (23BD) is a high-val

2,3-Butanediol (23BD) is a high-value chemical usually produced petrochemically but which can also be synthesized by some bacteria. To date, the best microbial 23BD production rates have been observed using pathogenic bacteria in fermentation systems that depend on sugars as the carbon and energy sources for product synthesis. Here we present evidence of 23BD production by three nonpathogenic acetogenic Clostridium species—Clostridium autoethanogenum, C. ljungdahlii, and C. ragsdalei—using carbon monoxide-containing industrial waste gases or syngas as the sole source of carbon and energy. Through an analysis of the C. ljungdahlii genome, the complete pathway from carbon monoxide to 23BD has been proposed. Homologues of the genes involved in this pathway were also confirmed for the other two species investigated. A gene expression study demonstrates a correlation between mRNA accumulation from 23BD biosynthetic genes and the onset of 23BD production, while a broader expression study of Wood-Ljungdahl pathway genes provides a transcription-level view of one of the oldest existing biochemical pathways.

Go to:
INTRODUCTION
2,3-Butanediol (23BD) is a commodity chemical usually produced from oil. It can be used as a precursor in the manufacture of a range of chemical products, including the solvents methyl ethyl ketone (MEK), gamma-butyrolactone (GBL), and 1,3-butadiene (13, 55, 58). Commercially, the key downstream products of 23BD have a potential global market of around 32 million tons per annum, valued at approximately $43 billion in sales.

23BD is known to be produced by a range of sugar (or citrate)-fermenting microbes, including Bacillus amyloliquefaciens (13), Bacillus subtilis (58), Enterobacter aerogenes (11), Klebsiella pneumoniae (7), Klebsiella oxytoca (51), Lactococcus lactis (26), Paenibacillus polymyxa (14), and Serratia marcescens (60). In this study, we present evidence of 23BD production by 3 acetogenic members of the Clostridium genus (Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei) using gases (carbon monoxide [CO] or hydrogen [H2] and CO) as the source of carbon and energy.

To date, acetogens have been reported to produce acetate, ethanol, butyrate, and butanol, all of which are synthesized directly from acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) (16, 34, 36). However, whether metabolites known to require pyruvate as a precursor for their synthesis can be produced in significant quantities by microbes using gases as opposed to carbohydrates as the source of metabolic carbon and energy has not yet been demonstrated. In this study, the production of the pyruvate-derived metabolites 23BD and lactate by acetogenic clostridia was investigated. The purpose of this study was 2-fold: to gain insight into the genetic control of carbon flow in acetogenic organisms and to gain insight into the potential versatility of such an approach as a platform for the production of a broader spectrum of fuel or chemical products.

The ability of microbes to use CO relies on the operation of the Wood-Ljungdahl metabolic pathway (Fig. 1 A). The biochemistry associated with this pathway has been described in a variety of excellent review articles (16, 17, 45, 56). CO and/or CO2 feeds the methyl (eastern) and carbonyl (western) branches of the pathway, resulting in the formation of acetyl-CoA, which serves as the central precursor for all catabolic and anabolic processes. In the methyl branch, CO or CO2 is fixed in a sequence of tetrahydrofolate (THF)- and cobalamin-dependent reactions into a methyl group, which is then combined with CO (used either directly or after enzymatic reduction of CO2) to form acetyl-CoA catalyzed by the CODH/ACS (carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA synthase) complex (Fig. 1A).

Fig. 1.
Fig. 1.
(A) Proposed pathway for production of 23BD and lactate from CO via the Wood-Ljungdahl pathway (16, 17, 45, 56). Single reactions shown do not represent stoichiometric fermentation balances. The graphs represent normalized mRNA levels over complete growth ...
Reducing equivalents required for metabolic processes are generated from either CO via the CODH enzyme or H2 via hydrogenase enzymes (33). In the absence of H2 in the input gas, the reducing equivalents are provided solely from CO via the biological water-gas shift reaction (CO + H2O → CO2 + 2 H+ + 2e−). If H2 is present in the gas, additional reducing equivalents are available (H2 → 2 H+ + 2e−), enabling a proportional increase in carbon assimilation. The use of CO (E0′ = −520 mV) and H2 (E0′ = −414 mV), which are not equivalent because of having significantly different redox potentials, allows a broad spectrum of resources to be considered for product synthesis (50).

The results presented herein show that the use of acetogens is a viable strategy for the production of 23BD. Furthermore, evidence for the biosynthetic pathway used for its synthesis from CO is given together with the results of a gene expression study examining the transcription of genes encoding biosynthetic enzymes from CO metabolism through to the biosynthesis of 23BD and lactate. Additionally, stereochemistry and toxicity analyses were undertaken to define the commercially important structural specificity and potential production limits of this molecule by gas fermentation.

Go to:
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and growth conditions.
C. autoethanogenum DSM 10061 and C. ljungdahlii DSM 13582 were obtained from the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany), and C. ragsdalei ATCC BAA-622 was obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). All organisms were cultivated under strict anaerobic conditions (29) in modified PETC medium (ATCC medium 1754 with yeast extract and fructose omitted) at 30°C (C. ragsdalei) or 37°C (C. autoethanogenum and C. ljungdahlii). Heterotrophic growth was performed on 0.5% (wt/vol) fructose, while steel mill waste gas (composition, 44% CO, 32% N2, 22% CO2, and 2% H2; collected from a steel site in Glenbrook, New Zealand) was used for autotrophic growth at a pressure of 200 kPa.

Growth experiments were carried out in 100 ml medium, using 500-ml Schott Duran GL45 Pressure Plus bottles with butyl rubber stoppers. 23BD and lactate toxicity experiments were performed in 125-ml Bellco serum bottles with butyl rubber septa, using 50 ml medium containing increasing concentrations of 23BD (distilled from broth of C. autoethanogenum) and dl-lactic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (NaOH was used to compensate the pH of the medium after addition of lactic acid). All growth experiments were performed at least in triplicate. Growth was monitored by measuring the optical density at 600 nm (OD600), and metabolic end products were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC).

Analytics.
Metabolite concentrations were routinely determined using an Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipped with a refractive index detector (RID) operated at 35°C and an Alltech IOA-2000 organic acid column. The column was kept at 60°C. Slightly acidified water (0.005 M H2SO4) was used as the mobile phase, with a flow rate of 0.7 ml/min. To remove proteins and other cell residues, 400 μl of sample was mixed with 100 μl of 2% (wt/vol) 5-sulfosalicylic acid, and the samples were centrifuged at 14,000 × g for 3 min. The supernatant (10 μl) was then injected into the HPLC for analysis. Optical activity was measured at room temperature on a polartronic NH8 instrument (Schmidt+Haensch, Berlin, Germany) at 589 nm and 20°C. Pure chiral standards [d-(−)-23BD, l-(+)-23BD, and meso-23BD] were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). For 23BD identification, an Agilent gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) system with a quadrupole mass selective detector operated at 70 eV was used. A ZB-1701 column (30 m by 250 μm by 150-μm film thickness) (Phenomenex, Torrance, CA) with a 5-m guard column was used for all analyses.

Sequencing and analysis of genes and enzymes.
The genome sequence of C. ljungdahlii (33) was retrieved from GenBank (accession no. NC_014328), while sequences of C. autoethanogenum and C. ragsdalei were obtained by a whole-genome shotgun approach combined with bidirectional primer walking.

Genomic DNAs used as templates were isolated from overnight cultures (6). One hundred milliliters of culture was harvested by centrifugation (6,000 × g, 15 min, 4°C), washed with potassium phosphate buffer (10 mM; pH 7.5), and suspended in 1.9 ml STE buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM sucrose [pH 8.0]). This suspension was treated with 300 μl lysozyme (∼100,000 U) for 30 min at 37°C and with 280 μl of an SDS solution (10% [wt/vol]) for 10 min. RNA was digested by addition of 240 μl of an EDTA solution (0.5 M; pH 8), 20 μl Tris-HCl (1 M; pH 7.5), and 10 μl RNase A (50,000 U). Proteolysis was achieved by addition of 100 μl proteinase K (0.5 U) for 1 to 3 h at 37°C. Finally, 600 μl of sodium perchlorate (5 M) was added, followed by phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation. The purity and quantity of DNA were verified using a NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) and a Qubit fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) as well as by gel electrophoresis.

Shotgun sequencing (39) was carried out using a 454 GS FLX Titanium instrument (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). For C. autoethanogenum, 511,611 reads with a total length of 188,798,483 bp were obtained, and for C. ragsdalei, 430,028 reads totaling 150,049,168 bp were obtained, and the reads were assembled using the Newbler package (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Additionally, primer walking experiments using the Sanger method (47) were performed to confirm the identities of relevant sequences.

Genes and enzymes were predicted using the BLAST (3), COG (53), and TIGRFAM (25) databases. Motif

Kết quả (Việt) 1:

2,3-Butanediol (23BD) là một chất hóa học cao-giá trị thường sản xuất petrochemically nhưng mà cũng có thể được tổng hợp bởi một số vi khuẩn. Đến nay, tỷ lệ sản xuất tốt nhất của vi khuẩn 23BD đã được quan sát bằng cách sử dụng các vi khuẩn gây bệnh trong hệ thống lên men mà phụ thuộc vào loại đường như là nguồn cacbon và năng lượng cho sản phẩm tổng hợp. Ở đây chúng tôi trình bày bằng chứng về sản xuất 23BD của ba nonpathogenic acetogen Clostridium loài — Clostridium autoethanogenum, C. ljungdahlii, và C. ragsdalei — sử dụng khí carbon monoxide có chứa khí thải công nghiệp hoặc syngas như là nguồn gốc duy nhất của cacbon và năng lượng. Thông qua một phân tích về bộ gen C. ljungdahlii, con đường hoàn thành từ khí carbon monoxide để 23BD đã được đề xuất. Lớn của các gen liên quan đến con đường này cũng đã được xác nhận cho các loài hai khác điều tra. Một biểu hiện gen nghiên cứu chứng tỏ một sự tương quan giữa mRNA tích lũy từ 23BD viêm gen và bắt đầu sản xuất 23BD, trong khi một nghiên cứu luận rộng hơn của gỗ-Ljungdahl đường gen cung cấp một cái nhìn cấp phiên mã của một trong các con đường sinh hóa lâu đời nhất sẵn có.Đi tới:GIỚI THIỆU2,3-Butanediol (23BD) là một hàng hóa hóa học thường được sản xuất từ dầu. Nó có thể được sử dụng như một tiền thân trong sản xuất một loạt các sản phẩm hóa chất, bao gồm dung môi methyl ethyl ketone (MEK), gamma-butyrolactone (GBL) và 1,3-butadiene (13, 55, 58). Thương mại, các sản phẩm hạ nguồn quan trọng của 23BD có một tiềm năng thị trường toàn cầu của khoảng 32 triệu tấn mỗi năm, có giá trị ở khoảng $43 tỷ doanh số bán hàng.23BD được biết là được sản xuất bởi một loạt các đường (hoặc citrate) -fermenting vi khuẩn, bao gồm Bacillus amyloliquefaciens (13), Bacillus subtilis (58), Enterobacter aerogenes (11), Klebsiella (7) pneumoniae, Klebsiella oxytoca (51), Lactococcus lactis (26), Paenibacillus polymyxa (14), và Serratia marcescens (60). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày bằng chứng về sản xuất 23BD bởi 3 thành viên acetogenic thuộc giống Clostridium (Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, và Clostridium ragsdalei) có sử dụng khí (carbon monoxide [CO] hoặc hydro [H2] và CO) như là nguồn carbon và năng lượng. Đến nay, acetogens đã được báo cáo để sản xuất acetate, ethanol, butyrate, và butanol, tất cả đều được tổng hợp trực tiếp từ acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) (16, 34, 36). Tuy nhiên, cho dù chất chuyển hóa được biết đến để yêu cầu pyruvate như một tiền chất để tổng hợp của họ có thể được sản xuất với số lượng lớn bởi các vi khuẩn sử dụng khí như trái ngược với carbohydrate là nguồn của sự trao đổi chất carbon và năng lượng vẫn chưa được chứng minh. Trong nghiên cứu này, việc sản xuất của các chất chuyển hóa pyruvate có nguồn gốc từ 23BD và lactate bởi clostridia acetogenic đã được điều tra. Mục đích của nghiên cứu này là 2 lần: để đạt được cái nhìn sâu sắc vào sự kiểm soát di truyền của dòng carbon trong vật acetogenic và để đạt được cái nhìn sâu sắc vào sự linh hoạt tiềm năng của một cách tiếp cận như một nền tảng cho việc sản xuất của một phổ rộng hơn về nhiên liệu hoặc sản phẩm hóa học . Khả năng của vi khuẩn để sử dụng CO dựa trên các hoạt động của con đường chuyển hóa gỗ Ljungdahl (Fig. 1 A). Hóa sinh gắn liền với con đường này đã được mô tả trong một loạt các bài báo đánh giá xuất sắc (16, 17, 45, 56). CO và / hoặc CO2 nguồn cấp dữ liệu methyl (phía đông) và cacbonyl (phía tây) chi nhánh của con đường, dẫn đến sự hình thành của acetyl-CoA, phục vụ như là tiền thân của trung tâm cho tất cả các quá trình dị hóa và đồng hóa. Trong ngành methyl, CO hoặc CO2 được cố định trong một chuỗi các tetrahydrofolate (THF) - và các phản ứng phụ thuộc vào cobalamin một nhóm methyl, mà sau đó được kết hợp với CO (được sử dụng trực tiếp hoặc sau khi giảm enzyme của CO2) để tạo thành acetyl- CoA được xúc tác bởi các CODH / ACS (carbon monoxide dehydrogenase / acetyl-CoA synthase) phức tạp (Hình. 1A). Fig. 1. Hình. 1. (A) con đường được đề xuất để sản xuất 23BD và lactate từ CO qua con đường gỗ Ljungdahl (16, 17, 45, 56). Phản ứng duy nhất thể hiện không đại diện cho số dư lên men cân bằng hóa học. Các đồ thị đại diện cho bình thường hóa mức độ mRNA hơn tăng trưởng ... hoàn Giảm các khoản tương đương cần thiết cho quá trình trao đổi chất được tạo ra từ một trong hai CO qua các enzym CODH hoặc H2 qua enzyme hydrogenase (33). Trong trường hợp không có H2 trong khí đầu vào, tương đương giảm được cung cấp chỉ từ CO qua phản ứng chuyển dịch nước và khí sinh học (CO + H2O → CO2 + 2 H + + 2e-). Nếu H2 có mặt trong khí, tương đương giảm bổ sung có sẵn (H2 → 2 H + + 2e-), cho phép tăng tỷ lệ carbon đồng hóa. Việc sử dụng CO (E0 '= -520 mV) và H2 (E0' = -414 mV), mà không phải là tương đương vì có tiềm năng oxi hóa khử khác nhau đáng kể, cho phép một loạt các nguồn lực để được xem xét cho sản phẩm tổng hợp (50) . Các kết quả được trình bày trong tài liệu này cho thấy rằng việc sử dụng các acetogens là một chiến lược khả thi để sản xuất 23BD. Hơn nữa, bằng chứng cho quá trình tổng hợp được sử dụng để tổng hợp từ CO được dùng cùng với các kết quả của một nghiên cứu biểu hiện gen kiểm tra các phiên mã của các gen mã hóa enzyme tổng hợp sinh học từ quá trình chuyển hóa CO qua để sinh tổng hợp các 23BD và lactate. Ngoài ra, các phân tích hóa học lập thể và độc tính đã được thực hiện để xác định các đặc trưng cấu trúc và tiềm năng sản xuất giới hạn thương mại quan trọng của phân tử này bằng cách lên men khí. Tới: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . vi khuẩn chủng và điều kiện sinh trưởng C. autoethanogenum DSM 10061 và C. ljungdahlii DSM 13.582 thu được từ các DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Đức), và C. ragsdalei ATCC BAA-622 được lấy từ Type Collection Văn hóa Mỹ (Manassas, VA). Tất cả các sinh vật được nuôi trồng trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt (29) trong sửa đổi vừa PETC (ATCC trung 1754 với chiết xuất nấm men và fructose bỏ qua) ở 30 ° C (C. ragsdalei) hoặc 37 ° C (C. autoethanogenum và C. ljungdahlii). Tăng trưởng dị dưỡng đã được thực hiện trên 0,5% (wt / vol) fructose, trong khi khí thải nhà máy thép (thành phần, 44% CO, 32% N2, 22% CO2, và 2% H2; thu thập từ một trang web thép trong Glenbrook, New Zealand) đã được sử dụng cho sự phát triển tự dưỡng ở áp suất 200 kPa. thí nghiệm tăng trưởng đã được thực hiện trong 100 ml trung bình, sử dụng 500-ml Schott Duran GL45 áp Thêm chai có nút cao su butyl. 23BD và thí nghiệm độc tính lactate được thực hiện trong 125 ml Bellco chai huyết thanh với vách cao su butyl, sử dụng 50 ml môi trường có nồng độ ngày càng tăng của 23BD (chưng cất từ nước dùng của C. autoethanogenum) và dl-lactic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO) (NaOH đã được sử dụng để bù độ pH của môi trường sau khi thêm axit lactic). Tất cả các thí nghiệm tăng trưởng đã được thực hiện ít nhất trong ba lần. Tăng trưởng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang ở 600 nm (OD600), và sản phẩm cuối cùng chuyển hóa đã được phân tích bởi hiệu suất cao sắc ký lỏng (HPLC).
Analytics.
nồng độ chất chuyển hóa cũng thường xuyên được xác định bằng cách sử dụng một Agilent 1100 loạt hệ thống HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) được trang bị với một chỉ số khúc xạ dò (RID) hoạt động ở 35 ° C và một cột axit hữu cơ Alltech IOA-2000. Các cột được giữ ở 60 ° C. Nước hơi acid hóa (0,005 M H2SO4) được sử dụng như là giai đoạn di động, với một tốc độ dòng chảy 0,7 ml / phút. Để loại bỏ các protein và các chất thải tế bào khác, 400 ml mẫu được trộn với 100 ml 2% (wt / vol) acid 5-sulfosalicylic, và các mẫu được ly tâm ở 14.000 × g trong vòng 3 phút. Các dịch nổi (10 ml) sau đó được tiêm vào HPLC để phân tích. Hoạt động quang được đo ở nhiệt độ phòng trên một NH8 cụ polartronic (Schmidt + Haensch, Berlin, Đức) tại 589 nm và 20 ° C. Tiêu chuẩn chiral tinh khiết [d - (-) - 23BD, l - (+) - 23BD, và meso-23BD] đã thu được từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Đối với 23BD xác định, một sắc ký khí khối phổ Agilent hệ thống (GC-MS) với một tứ cực phát hiện hàng loạt lựa chọn hoạt động ở 70 eV được sử dụng. Một cột ZB-1701 (30 m 250 mm bằng chiều dầy 150 micron) (Phenomenex, Torrance, CA) với 5 m cột bảo vệ đã được sử dụng cho tất cả các phân tích. Sequencing và phân tích gen và enzym. Các trình tự bộ gen của C. ljungdahlii (33) đã được lấy ra từ GenBank (nhập không NC_014328.), trong khi các trình tự của C. autoethanogenum và C. ragsdalei đã thu được bằng phương pháp shotgun cả hệ gen kết hợp với hai chiều mồi đi bộ. DNA bộ gen được sử dụng như là các mẫu được phân lập từ các nền văn hóa qua đêm (6). Một trăm mililít văn hóa đã được thu hoạch bằng cách ly tâm (6.000 × g, 15 phút, 4 ° C), rửa sạch với đệm kali photphat (10 mM, pH 7,5), và bị đình chỉ trong 1,9 ml STE đệm (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM sucrose [pH 8,0]). Hệ thống treo này đã được điều trị với 300 ml lysozyme (~100,000 U) cho 30 phút ở 37 ° C và với 280 ml ​​dung dịch SDS (10% [wt / vol]) trong 10 phút. RNA được tiêu hóa bằng cách bổ sung 240 ml dung dịch EDTA (0,5 M; pH 8), 20 ml Tris-HCl (1 M, pH 7,5), và 10 ml RNase A (50.000 U). Sự phân giải protein đã đạt được bằng cách bổ sung 100 ml proteinase K (0,5 U) cho 1-3 giờ ở 37 ° C. Cuối cùng, 600 ml natri perchlorate (5 M) đã được bổ sung, tiếp theo là khai thác phenol-chloroform và lượng mưa isopropanol. Độ tinh khiết và số lượng DNA đã được xác nhận bằng cách sử dụng một máy quang phổ NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) và một fluorometer qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA) cũng như bằng gel điện di. Shotgun trình tự (39) đã được thực hiện bằng cách sử dụng một 454 GS FLX Titanium cụ (Roche Khoa học ứng dụng, Indianapolis, IN). Đối với C. autoethanogenum, 511.611 lần đọc với tổng chiều dài là 188.798.483 bp thu được, và cho C. ragsdalei, 430.028 lần đọc tổng cộng 150.049.168 bp thu được, và lần đọc được lắp ráp bằng cách sử dụng các gói Newbler (Roche Khoa học ứng dụng, Indianapolis, IN). Ngoài ra, các thí nghiệm đi bộ mồi bằng cách sử dụng phương pháp Sanger (47) đã được thực hiện để xác nhận danh tính của các trình tự có liên quan. Các gen và enzyme được dự đoán bằng cách sử dụng BLAST (3), COG (53), và TIGRFAM (25) cơ sở dữ liệu. Motif