Anti-EBV CRISPR experimentsEBV miRN

Anti-EBV CRISPR experiments
EBV miRNA sensor experiments were performed in latent EBV-positive SNU719 cells. Cells were transduced with control or anti-EBV miRNA gRNAs (see S1 Table for sequences), selected by puromycin for 2 days, and allowed to recover for ±12 days. Subsequently, cells were transduced with mCherry EBV miRNA sensors for BART5-5p, BART6-3p, or BART16-5p and analyzed by flow cytometry 4 dpi to assess miRNA activity in these cells (FACSCantoII, BD). CRISPR-induced editing of the EBV genome was assessed in anti-BART5 and anti-BART16 gRNAs expressing cells by amplifying these loci by PCR amplification using primers 5’-CGGGCTATATGTCGCCTTAC-3’ and 5’-AGAGGGTGGTGATCTTGGTG-3’ for EBV BART5 and 5’-CCAGGTCAGTGGTTTTGTTTC-3’ and 5’-TGGACCAACCTTAAAGTACCAAC-3’ for EBV BART16. Subsequently, PCR products were cloned in the pCR2.1-TOPO vector according manufacturers’ recommendations (Life technologies), transformed in Turbo competent cells (New England Biolabs) and several clones were mini-prepped (Fermentas) and subjected to sequencing (Macrogen Inc) using the M13-reverse primer 5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’. Sequence analysis was carried out using the Lasergene DNASTAR software package.

Kết quả (Việt) 1:

Anti-EBV CRISPR thí nghiệmEBV Tam cảm biến thử nghiệm đã được thực hiện trong tiềm ẩn tích cực EBV SNU719 tế bào. Các tế bào đã được transduced với kiểm soát hoặc anti-EBV Tam gRNAs (xem S1 bảng cho trình tự), được chọn bởi puromycin để 2 ngày, và cho phép phục hồi trong ±12 ngày. Sau đó, các tế bào đã được transduced với mCherry EBV Tam cảm biến cho BART5 - 5p, BART6 - 3p hoặc BART16 - 5p và phân tích bởi cytometry dòng chảy 4 dpi để đánh giá Tam hoạt động trong các tế bào (FACSCantoII, BD). Gây ra CRISPR chỉnh sửa của gen EBV được đánh giá ở gRNAs anti-BART5 và anti-BART16 thể hiện các tế bào bằng cách khuyếch đại những loci bởi khuếch đại PCR sử dụng lớp lót 5'-CGGGCTATATGTCGCCTTAC-3' và 5'-AGAGGGTGGTGATCTTGGTG-3' EBV BART5 và 5'-CCAGGTCAGTGGTTTTGTTTC-3' và 5'-TGGACCAACCTTAAAGTACCAAC-3' cho EBV BART16. Sau đó, sản phẩm PCR được nhân bản trong pCR2.1-TOPO vector theo khuyến nghị của nhà sản xuất (công nghệ cuộc sống), chuyển đổi trong các tế bào có thẩm quyền Turbo (New England Biolabs) và bắt chước một số đã là mini prepped (Fermentas) và chịu các trình tự (Macrogen Inc) bằng cách sử dụng đảo ngược M13 mồi 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'. Phân tích trình tự được thực hiện bằng cách sử dụng các gói phần mềm Lasergene DNASTAR.

Kết quả (Việt) 2:

Anti-EBV thí nghiệm CRISPR
EBV miRNA thí nghiệm cảm biến đã được thực hiện trong các tế bào SNU719 EBV dương tiềm ẩn. Các tế bào được tải nạp với kiểm soát hoặc chống EBV miRNA gRNAs (xem Bảng S1 cho các trình tự), chọn puromycin 2 ngày, và cho phép phục hồi cho ± 12 ngày. Sau đó, các tế bào được tải nạp với cảm biến mCherry EBV miRNA cho BART5-5p, BART6-3p, hoặc BART16-5p và phân tích bởi dòng cytometry 4 dpi để đánh giá hoạt động của miRNA trong các tế bào (FACSCantoII, BD). Chỉnh sửa CRISPR gây ra của bộ gen EBV được đánh giá trong chống BART5 và chống BART16 gRNAs hiện các tế bào bằng cách khuếch đại các locus của khuếch đại PCR sử dụng mồi 5'-CGGGCTATATGTCGCCTTAC-3 'và 5'-AGAGGGTGGTGATCTTGGTG-3' cho EBV BART5 và 5 '-CCAGGTCAGTGGTTTTGTTTC-3' và 5'-TGGACCAACCTTAAAGTACCAAC-3 'cho EBV BART16. Sau đó, các sản phẩm PCR được nhân bản vô tính trong vector pCR2.1-TOPO tùy theo khuyến nghị của nhà sản xuất (công nghệ Life), chuyển đổi các tế bào có thẩm quyền Turbo (New England Biolabs) và một số nhái là mini-prepped (Fermentas) và bị giải trình tự (Macrogen Inc ) bằng cách sử dụng mồi M13-ngược 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3 '. Phân tích trình tự đã được thực hiện bằng cách sử dụng gói phần mềm Lasergene DNASTAR.