Lentiviral CRISPR/Cas9 vector and o

Lentiviral CRISPR/Cas9 vector and other DNA vectors
We constructed a selectable lentiviral CRISPR/Cas vector by altering the lentiviral pSicoR vector [86] (Addgene plasmid 11579, Tyler Jacks Lab, MIT) to express a human codon-optimized nuclear-localized codon-optimized S. pyogenes Cas9 gene (taken from Addgene plasmid 42229 [17], Zhang lab) that was N-terminally fused to PuroR via a T2A ribosome-skipping sequence [87]. This cassette was expressed from the human EF1A promoter. Additionally, we replaced the mouse U6 promoter with a human U6 promoter which drives expression of a guideRNA (gRNA) consisting of a 18-20bp target-specific CRISPR RNA (crRNA) fused to the trans-activating crRNA (tracrRNA) [88] and a terminator sequence. We generated a second variant of this vector, replacing the PuroR gene for a BlastR gene. These vectors are called pSicoR-CRISPR-PuroR and pSicoR-CRISPR-BlastR respectively. The pSicoR-CRISPR-PuroR vector was previously successfully used in Van de Weijer et al [89].

Kết quả (Việt) 1:

Lentiviral CRISPR/Cas9 vector và DNA khác vectơChúng tôi đã xây dựng một vector CRISPR/Cas lentiviral lựa chọn bằng cách thay đổi các véc tơ lentiviral pSicoR [86] (Addgene plasmid 11579, Tyler Jacks Lab, MIT) để thể hiện một gen của con người codon tối ưu hóa hạt nhân bản địa hoá tối ưu hóa codon S. pyogenes Cas9 (Lấy từ Addgene plasmid 42229 [17], trương phòng thí nghiệm) là N-nan y hợp nhất với PuroR thông qua một T2A bỏ qua ribosome trình tự [87]. Băng này được thể hiện từ promoter EF1A của con người. Ngoài ra, chúng tôi thay thế chuột U6 promoter một promoter U6 của con người mà các ổ đĩa các biểu hiện của một guideRNA (gRNA) bao gồm một 18-20bp mục tiêu cụ thể CRISPR RNA (crRNA) hợp nhất để trans kích hoạt crRNA (tracrRNA) [88] và một trình tự hủy diệt. Chúng tôi tạo ra một phiên bản thứ hai của vectơ này, thay thế các gen PuroR cho một gen BlastR. Các vector được gọi là pSicoR-CRISPR-PuroR và pSicoR-CRISPR-BlastR tương ứng. Vector pSicoR-CRISPR-PuroR đã từng thành công được sử dụng trong Van de Weijer et al [89].

Kết quả (Việt) 2:

Lentivirus CRISPR / Cas9 vector và vector DNA khác
Chúng tôi đã xây dựng một lựa chọn lentivirus CRISPR / Cas vector bằng cách thay đổi các vector lentivirus pSicoR [86] (Addgene plasmid 11.579, Tyler Jacks Lab, MIT) để diễn tả một codon- hạt nhân nội địa hóa codon được tối ưu hóa của con người gen S. pyogenes Cas9 tối ưu hóa (lấy từ Addgene plasmid 42.229 [17], Zhang phòng thí nghiệm) mà là N-nan hợp nhất để PuroR qua một T2A ribosome bỏ qua chuỗi [87]. Băng này được thể hiện từ promoter EF1A con người. Ngoài ra, chúng tôi thay thế các promoter chuột U6 với một promoter U6 con người mà ổ đĩa biểu hiện của một guideRNA (gRNA) bao gồm một CRISPR RNA 18-20bp mục tiêu cụ thể (crRNA) hợp nhất để trans kích hoạt crRNA (tracrRNA) [88] và một chuỗi terminator. Chúng tôi tạo ra một biến thể thứ hai của vector này, thay thế các gen PuroR cho một gen BlastR. Những vectơ được gọi là pSicoR-CRISPR-PuroR và pSicoR-CRISPR-BlastR tương ứng. Các vector pSicoR-CRISPR-PuroR đã được sử dụng trước đó thành công trong Van de Weijer et al [89].