C H A P T E R23Negative StainingWer

C H A P T E R

23




Negative Staining

Werner Baschong and Ueli Aebi







I. I N T R O D U C T I O N

Heavy metal negative staining, a now widely used routine technique to prepare biological material for imaging in the transmission electron microscope (TEM), was introduced almost 50 years ago (Brenner and Horne, 1959; for reviews, see Oliver, 1973; Horne, 1991). Suitable specimens may either be in solution or in suspension and thus include the whole spectrum of structural organization of biomolecules, ranging from monomeric and oligomeric proteins [e.g., RNA poly- merase (Fig. la) or glutamine synthetase (Fig. lb, bottom)], to protein polymers [e.g., cytoskeletal fila- ments or the multistranded helical cables of glutamine synthetase (Fig. lb, top)], and eventually to large multi- component supramolecular assemblies [e.g., nuclear pore complexes or bacteriophages (Fig. lc)]. Com- pared to other electron microscopic techniques, nega- tive staining is remarkably simple and can easily provide reliable structural information as quickly as 2min after preparing the specimen down to resolu- tions of 2.0nm (reviewed by Bremer et al., 1992) and below (Harris, 1999).

As shown schematically in Fig. 2a, a negatively stained specimen is embedded in a microcrystalline heavy atom salt replica that portrays its molecular architecture. Because heavy metal atoms (e.g., U, V, W, Au, Mo, Pt, Pb, Os) scatter electrons much more strongly than elements constituting the biomolecules (i.e., C, H, O, N, P, S), the contrast of negatively stained specimens (Fig. 2b) is much higher than that of unstained specimens and reversed (hence "negative" staining). In addition, the heavy metal salt replica sta- bilizes the specimen against collapse and distortion and substitutes, at least partially, for the aqueous envi- ronment typical for biomolecules. It also serves as a





radiation protectant in the sense that it is more radia- tion resistant than biological matter (cf. Aebi et al., 1984; Bremer and Aebi, 1992).



II. M A T E R I A L S A N D I N S T R U M E N T A T I O N

Negative staining requires only minor investment for instrumentation and supplies. For routine applica- tions, the following items are needed.

Specimen support grids (Fig. 3a): For example, from Pelco International (www.pelcoint.com). Typi- cally 200-400 mesh/in, copper grids, 3.05 mm in diam- eter and 0.7 mm thick, coated with a specimen support film (mostly either a carbon/collodion composite film, or a thin carbon film). The specimen grids should be stored dust free, e.g., in a petri dish (Fig. 3b) that is kept at relatively low humidity.

Precision forceps (Fig. 3c): For example, from Electron Microscopy Sciences (www.emsdiasum.com). It is advisable to bend the jaws of the forceps slightly inwards to prevent surface tension from trapping buffers and solutes between the jaws. A tightly fitting rubber band or piece of plastic tubing allows the jaws to be fixed in the closed state.

Glow discharge unit (Fig. 3d). It is used to render the support film of the specimen grids hydrophilic and can be built as detailed by Aebi and Pollard (1987). The specimen grid is glow discharged on a small glass block coated with Parafilm (Fig. 3d, arrowhead).

A metal or plastic tray (Fig. 3e) serves as the "workbench." Drops of water and stain, typically
btl each, can be placed on a piece of Parafilm (Fig. 3e,



2 3 4 ELECTRON MICROSCOPY

























F I G U R E 1 From molecules to replicating molecular machines--examples of negatively stained preparations. (a) Monomers of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme. (b) Glutamine synthetase from E. coli. (Top) Helical filaments are formed in the presence of millimolar amounts of Co2§ions. (Bottom) The intact enzyme molecule is composed of 12 identical 50-kDa subunits that associate with 622 symmetry: i.e., end-on views display a typical blossom-like appearance with six-fold symmetry, whereas side views reveal twofold symmetry. (c) E. coli bac- teriophage T4: organization into a distinct prolate icosahedral head and a contractile helical tail to which a base plate with extended fibers is attached at the bottom are evident. RNA polymerase (a) and glutamine synthetase (b) were stained with 0.75% uranyl formate; and bacterio- phage T4 (c) was stained with 1% uranyl acetate. Scale bar: 100nm.



F I G U R E 2 Schematic representation of a "negatively stained" model specimen. (a) The schematic view represents a cross section through a model specimen (light grey) that has been embedded in an ideal negative stain (dark grey). (b) The schematic view in a was projected by adding the pixel values along the vertical axis. The projection profile of the "negatively stained" model specimen is represented by a thick black trace, whereas the projection profile of the "unstained" model specimen is depicted by a thinner grey trace. In the case of the "negatively

stained" specimen, its projection profile was inverted, i.e., multiplied b y - 1 , to compare it directly with the corresponding profile of the

"unstained" specimen.

NEGATIVESTAINING 2 3 5

FIGURE 3 Materials and equipment required for negative staining. (a) Specimen support grid (e.g., 200 mesh/in, copper grid, 3.05mm in diameter and 0.7 mm thick) coated with a collodion-carbon composite film (the support film is particularly evident at the edges). (b) The specimen support grids are stored on filter paper in a covered petri dish (the cover is removed for clarity). (c) Precision forceps with the jaws slightly bent inwards are used for all manipulations. (d) The specimen grids are rendered hydrophilic in a reduced atmosphere of air using a custom-built glow-discharge unit (for the design, see Aebi and Pollard, 1987). The specimen grids are glow discharged on a small glass block that is covered with Parafilm (see arrowhead). (e) A plastic or metal tray serves as the "workbench" for staining. The water and stain drops are placed on a piece of Parafilm on the left, the glass block with a glow discharged grid is seen on right at the back, and a piece of filter paper is depicted in the front.





3. Negative stain, i.e., heavy metal solution. For instance,



III. PROCEDURES

Solutions

The f o l l o w i n g s o l u t i o n s are r e q u i r e d for n e g a t i v e staining.

Specimen solution~suspension

Deionized or, even better, double-distilled water. W a t e r

is r e q u i r e d for w a s h i n g the s p e c i m e n grid after

s p e c i m e n a d s o r p t i o n .




23 6 ELECTRONMICROSCOPY


F I G U R E 4 Negative staining. (a) A N5-bd drop of sample solution/suspension is placed onto a glow- discharged specimen support grid that is held horizontally by a pair of forceps and allowed to adsorb for 30-60 s. (b) The specimen grid is then turned vertically and (c) allowed to gently touch the filter paper, which (d) removes excess liquid. (e) The adsorbed specimen is then washed by carefully placing it sideways onto a drop of water for i s, blotted as shown in b-d, and washed a second time. The actual staining is performed similarly by first washing the specimen grid on a drop of negative stain as described in e, blotting and repeat- ing this step once more, this time leaving the specimen grid for 10s on the drop of negative stain solution. (f) After blotting off excess stain, the residual stain is removed by gently moving a capillary (drawn-out and shaped from a Pasteur pipette) around the edge of the grid. The capillary is connected to a low-vacuum suction device (e.g., a water jet pump).


Filter the solution through a 0.2-~m membrane filter [e.g., a Supor 0.2-btm Acrodisc 32 from Gelman Sciences (www.pall.com)].

Adjust the pH to 4.25 by adding 10 N NaOH (about

2btl per l m l negative stain solution). The uranyl formate solution should turn into a moderately intense yellow (Caution: Increasing the pH toward neutral rapidly leads to precipitation of uranyl salts.)

Stir for another 5 min in the dark.

Filter a second time.

Readjust the volume with double-distilled water to compensate for water loss due to evaporation, filtration, etc.

Store stain in the dark (e.g., in a tube wrapped into aluminum foil). It will keep stable for 1-2 days.

Note: Uranyl formate may be difficult to purchase: Try, e.g., www.pfaltzandbauer.com (Pfaltz & Bauer Inc., Waterbury, CT 06708).

B. Staining

Our standard staining procedure for soluble pro- teins and their supramolecular assemblies is illus- trated in Fig. 4.

Kết quả (Việt) 1:

Chương

23






nhuộm âm werner baschong và Ueli aebi







i. giới thiệu

nặng nhuộm âm kim loại, một kỹ thuật thông thường đang được sử dụng rộng rãi để chuẩn bị vật liệu sinh học cho hình ảnh trong kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), đã được giới thiệu gần 50 năm trước đây (Brenner và Horne, 1959, vì đánh giá, nhìn thấy Oliver, 1973; Horne, 1991).mẫu phù hợp hoặc có thể trong giải pháp hay trong hệ thống treo và do đó bao gồm toàn bộ các tổ chức cấu trúc của phân tử sinh học, từ protein monomeric và oligomeric [ví dụ, RNA poly-merase (hình la) hoặc glutamine synthetase (hình lb, dưới) ], để polyme protein [ví dụ, cytoskeletal Fila được hoặc các loại cáp xoắn multistranded của glutamine synthetase (hình lb, hàng đầu)],và cuối cùng để lắp ráp siêu phân tử lớn đa phần [ví dụ, khu phức hợp hạt nhân hoặc lỗ chân lông khuẩn (Hình lc)]. com so với các kỹ thuật hiển vi điện tử khác, nhuộm nega cực là khá đơn giản và có thể dễ dàng cung cấp thông tin đáng tin cậy về cấu trúc như một cách nhanh chóng như 2min sau khi chuẩn bị mẫu vật xuống nghị quyết chức của 2.0nm (xem xét bởi Bremer et al.,1992) và dưới (Harris, 1999).

Như sơ đồ trong hình. 2a, một mẫu màu tiêu cực được nhúng vào trong một vi nặng bản sao muối nguyên tử miêu tả kiến ​​trúc phân tử của nó. bởi vì các nguyên tử kim loại nặng (ví dụ, u, v, w, au, mo, pt, pb, hệ điều hành) các điện tử phân tán nhiều hơn nữa mạnh mẽ hơn so với các yếu tố cấu thành các phân tử sinh học (ví dụ, c, h, o, n, p, s),độ tương phản của mẫu màu tiêu cực (Hình 2b) là cao hơn nhiều so với các mẫu vật không nhiễm ô và ngược lại (vì thế "tiêu cực" nhuộm). Ngoài ra, các bản sao muối kim loại nặng sta-bilizes mẫu vật chống lại sự sụp đổ và biến dạng và thay thế, ít nhất là một phần, cho dung dịch nước môi ronment điển hình cho phân tử sinh học. nó cũng là một





chất bảo vệ bức xạ trong ý nghĩa là nó là khả năng chống Radia hóa hơn vấn đề sinh học (x. aebi và cộng sự, 1984;. Bremer và aebi, 1992).



ii. materialsandinstrumen tation

nhuộm âm chỉ cần đầu tư nhỏ cho các thiết bị, vật tư. thường xuyên cho những ứng dụng, các mục sau đây là cần thiết

lưới hỗ trợ mẫu (hình 3a). ví dụ,từ Pelco quốc tế (www.pelcoint.com). typi-Cally 200-400 lưới / trong, lưới đồng, 3,05 mm đường kính-eter và dày 0,7 mm, tráng với một bộ phim hỗ trợ mẫu (chủ yếu là một trong hai bộ phim composite carbon / thuốc dán, hoặc một bộ phim carbon mỏng). lưới mẫu nên được lưu trữ bụi miễn phí, ví dụ như, trong một đĩa cấy (hình 3b) được giữ ở độ ẩm tương đối thấp.

Chính xác kẹp (hình 3c):ví dụ, từ khoa học hiển vi điện tử (www.emsdiasum.com). thì nên uốn cong hàm của kẹp nhẹ vào bên trong để ngăn chặn sức căng bề mặt từ bộ đệm bẫy và chất tan giữa hàm. một ban nhạc cao su chặt chẽ phù hợp hoặc mảnh của ống nhựa cho phép hàm phải được cố định ở trạng thái đóng.

Ánh sáng đơn vị xả (hình 3D).nó được sử dụng để làm cho bộ phim hỗ trợ lưới mẫu thấm nước và có thể được xây dựng như chi tiết của aebi và Pollard (1987). lưới điện mẫu là ánh sáng thải trên một khối thủy tinh nhỏ phủ Parafilm (hình 3d, đầu mũi tên).

Một kim loại hoặc khay nhựa (hình 3e) phục vụ như là "bàn làm việc." giọt nước và vết bẩn, thường
BTL mỗi, có thể được đặt trên một mảnh Parafilm (hình 3e,



2 3 4 kính hiển vi điện tử

























hình 1 từ phân tử đến các máy phân tử sao chép - ví dụ về các tiêu cực chuẩn bị nhuộm màu. (A) monome của Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme. (B) synthetase glutamine từ điện tử. coli. (Mới nhất) xoắn sợi được hình thành trong sự hiện diện của một lượng millimolar của CO2 § ion.(Dưới) phân tử enzyme còn nguyên vẹn bao gồm 12 tiểu đơn vị giống hệt nhau 50-kDa liên kết với 622 đối xứng: tức là, cuối cùng về quan điểm hiển thị hoa giống như sự xuất hiện điển hình đối xứng với sáu lần, trong khi nhìn bên tiết lộ đối xứng gấp đôi. (C) e. coli bac-teriophage t4:tổ chức thành một biệt dài ra đầu icosahedral và một cái đuôi xoắn bóp mà một đế với sợi mở rộng được gắn ở phía dưới là hiển nhiên. RNA polymerase (a) và glutamine synthetase (b) được nhuộm màu với 0,75% uranyl format và bacterio-thể thực khuẩn T4 (c) được nhuộm với 1% uranyl acetate. thanh quy mô:. 100nm



hình 2 sơ đồ đại diện của một mô hình mẫu "tiêu cực màu". (A) xem sơ đồ đại diện cho một mặt cắt ngang qua một mẫu mô hình (ánh sáng màu xám) đã được nhúng vào trong một lý tưởng tiêu cực vết (màu xám đen). (B) xem sơ đồ trong một được chiếu bằng cách thêm các giá trị điểm ảnh dọc theo trục thẳng đứng.hồ sơ cá nhân chiếu của mô hình mẫu "tiêu cực màu" được đại diện bởi một dấu vết đen dày, trong khi hồ sơ dự của mô hình mẫu "nhuộm màu" được mô tả bởi một dấu vết màu xám mỏng hơn. trong trường hợp của "tiêu cực

màu" mẫu, hồ sơ chiếu của nó đã được đảo ngược, tức là, nhân - 1, để so sánh trực tiếp với các hồ sơ tương ứng của

Mẫu "nhuộm màu".

Negativestaining 2 3 5

con số 3 vật liệu và thiết bị cần thiết để nhuộm âm. (A) lưới hỗ trợ mẫu (ví dụ, 200 lưới / trong, lưới đồng, 3.05mm đường kính và dày 0,7 mm) được phủ một bộ phim hợp thuốc dán-carbon (bộ phim hỗ trợ đặc biệt rõ ràng ở các cạnh).(B) lưới hỗ trợ cá thể được lưu trữ trên giấy lọc trong đĩa petri phủ (bìa được lấy ra cho rõ ràng). (C) kẹp chính xác với hàm hơi cong vào bên trong được sử dụng cho tất cả các thao tác. (D) lưới mẫu được trả lại ưa nước trong một bầu không khí giảm không khí sử dụng một đơn vị ánh sáng xả tùy chỉnh xây dựng (đối với thiết kế, xem aebi và cây bị chặt, 1987).lưới mẫu là ánh sáng thải trên một khối thủy tinh nhỏ được che phủ bởi Parafilm (xem mũi tên). (E) bằng nhựa hoặc kim loại khay phục vụ như là "bàn làm việc" cho nhuộm. nước và vết bẩn giọt được đặt trên một mảnh Parafilm trên bên trái, khối thủy tinh với ánh sáng lưới thải được nhìn thấy trên bên phải ở phía sau, và một mảnh giấy lọc được mô tả ở phía trước.





3.tiêu cực vết, ví dụ, giải pháp kim loại nặng. Ví dụ,



iii. thủ tục



các giải pháp followingsolutions được yêu cầu cho nhuộm âm.

giải pháp mẫu ~ đình chỉ

khử i-on hoặc, thậm chí tốt hơn, nước hai cất. nước

là cần thiết để làm sạch lưới mẫu sau

specimenadsorption.




23 6 electronmicroscopy


hình 4 nhuộm âm. (A) giảm N 5-bd của dung dịch mẫu / đình chỉ được đặt vào một ánh sáng-xả mẫu hỗ trợ mạng lưới được tổ chức theo chiều ngang bởi một cặp kẹp và được hấp thu cho 30-60 s. (B) lưới mẫu sau đó được quay theo chiều dọc và (c) cho phép để nhẹ nhàng chạm vào giấy lọc, trong đó (d) loại bỏ chất lỏng dư thừa.(E) các mẫu hấp phụ sau đó được rửa sạch bằng cách cẩn thận đặt nó sang một bên vào một giọt nước cho được, xoá nhoà như trong bd, và rửa sạch một lần thứ hai. các nhuộm thực tế được thực hiện tương tự bằng cách đầu tiên rửa lưới mẫu trên giảm tiêu cực vết như được mô tả trong điện tử, thấm và lặp lại-ing bước này một lần nữa,thời gian này để lại lưới điện mẫu cho 10s trên các giải pháp giảm vết tiêu cực. (F) sau khi thấm ra vượt quá bẩn, các vết bẩn còn sót lại được lấy ra bằng cách nhẹ nhàng di chuyển một mao mạch (kéo dài ra và tạo hình từ một Pasteur pipette) xung quanh các cạnh của lưới điện. các mao mạch được kết nối với một thiết bị hút chân không thấp (ví dụ, một máy bơm phun nước).


lọc các giải pháp thông qua một 0.2-~ m màng lọc [e.g., một supor 0.2-btm acrodisc 32 từ khoa học Gelman (www.pall.com)].

Điều chỉnh pH đến 4,25 bằng cách thêm 10 n NaOH (khoảng

2btl mỗi Lml giải pháp vết tiêu cực). các giải pháp formate uranyl nên biến thành một màu vàng vừa phải cường độ cao (cảnh cáo:. tăng ph hướng trung lập nhanh chóng dẫn đến sự kết tủa của các muối uranyl)

khuấy động thêm 5 phút trong bóng tối.

Lọc một lần thứ hai.

điều chỉnh âm lượng bằng nước cất hai để bù đắp cho sự mất nước do bốc hơi, lọc, vv

cửa hàng vết trong bóng tối (ví dụ, trong một ống bọc trong lá nhôm). nó sẽ tiếp tục ổn định trong 1-2 ngày.

Lưu ý: uranyl format có thể khó khăn để mua: cố gắng, ví dụ như, www.pfaltzandbauer.com (pfaltz & Bauer inc, Waterbury, CT 06708.)

B.. nhuộm

thủ tục nhuộm tiêu chuẩn của chúng tôi để hòa tan các protein và lắp ráp siêu phân tử của họ là minh hoạ trated trong vả. 4.

Kết quả (Việt) 2:

C H một P T E R

23


tiêu cực nhuộm

Werner Baschong và Ueli Aebi


tôi. Tôi N T R O D U C T I O N

kim loại nặng tiêu cực nhuộm, một kỹ thuật thường xuyên bây giờ sử dụng rộng rãi để chuẩn bị các vật liệu sinh học cho các hình ảnh trong kính hiển vi điện tử truyền (TEM), đã được giới thiệu gần 50 năm trước đây (Brenner và Horne, 1959; để đánh giá, xem Oliver, 1973; Horne, 1991). Phù hợp với mẫu vật có thể hoặc là trong dung dịch hoặc trong hệ thống treo và do đó bao gồm toàn bộ quang phổ của cấu trúc tổ chức của biomolecules, khác nhau, từ monomeric và oligomeric protein [ví dụ:, RNA poly-merase (hình. La) hoặc glutamine synthetase (hình. lb, dưới cùng)], để protein polyme [ví dụ:, cytoskeletal fila-ments hoặc multistranded cáp xoắn ốc của glutamine synthetase (hình. lb, hàng đầu)], và cuối cùng đến lớn đa thành phần supramolecular [ví dụ:, khu phức hợp hạt nhân lỗ hoặc bacteriophage (hình lc)]. Com-pared để các kỹ thuật vi điện tử, nega-hoạt động cùng nhuộm là khá đơn giản và cung cấp có thể dễ dàng cho đáng tin cậy cấu trúc thông tin một cách nhanh chóng như 2 phút sau khi chuẩn bị mẫu vật xuống resolu-tions của 2.0nm (được nhận xét bởi Bremer et al., 1992) và bên dưới (Harris, 1999).

như minh hoạ schematically trong hình 2a, một mẫu tiêu cực màu được nhúng vào trong một bản sao muối nguyên tử nặng microcrystalline miêu tả kiến trúc phân tử của nó. Bởi vì nguyên tử kim loại nặng (U, V, W, Au, Mo, Pt, Pb, Hệ điều hành) phân tán điện tử nhiều hơn nữa mạnh mẽ hơn yếu tố tạo thành biomolecules (tức là, C, H, O, N, P, S), sự tương phản của mẫu vật tiêu cực màu (hình 2b) là cao hơn nhiều hơn của unstained mẫu vật và đảo ngược (vì thế "tiêu cực" nhuộm). Ngoài ra, kim loại nặng salt bản sao sta-bilizes mẫu vật chống lại sự sụp đổ và biến dạng và sản phẩm thay thế, tối thiểu một phần cho dung dịch envi-ronment điển hình cho biomolecules. Nó cũng phục vụ như một


bức xạ protectant trong ý nghĩa rằng nó là khả năng chịu radia-tion hơn vấn đề sinh học (x. Aebi et al., năm 1984; Bremer và Aebi, 1992).


II. M A T E R I A L S A N D I N S T R U M E N T A T I O N

tiêu cực nhuộm đòi hỏi đầu tư chỉ nhỏ cho các thiết bị đo đạc và tiếp liệu. Cho thói quen applica-tions, các mục sau đây là cần thiết.

mẫu vật hỗ trợ lưới (hình 3a): ví dụ, từ Pelco các quốc tế (www.pelcoint.com). Typi-cally 200-400 lưới /, đồng lưới, 3,05 mm diam-eter và cách 0.7 mm dày, phủ một mẫu vật hỗ trợ phim (chủ yếu là một bộ phim tổng hợp cacbon/collodion hoặc một bộ phim mỏng cacbon). Lưới mẫu vật nên được lưu trữ bụi miễn phí, ví dụ, trong một món ăn petri (hình 3b) mà giữ độ ẩm tương đối thấp.

Chính xác kẹp (hình 3c): Ví dụ, từ kính hiển vi điện tử các khoa học (www.emsdiasum.com). Đó là khuyến khích để uốn cong hàm kẹp hơi vào bên trong để ngăn chặn bề mặt căng thẳng từ bộ đệm bẫy và solutes giữa hàm. Một chặt chẽ phù hợp ban nhạc cao su hoặc mảnh của ống nhựa cho phép hàm được cố định trong bang đóng cửa.

Sáng xả đơn vị (hình 3d). Nó được sử dụng để hiển thị hỗ trợ phim của mẫu vật lưới Purifying và có thể được xây dựng như chi tiết bởi Aebi và Pollard (1987). Lưới điện mẫu là ánh sáng xuất viện ngày một khối thủy tinh nhỏ phủ Parafilm (hình 3d, arrowhead).

Một khay kim loại hay nhựa (hình 3e) phục vụ như là "bàn làm việc." Giọt nước và vết, thường
btl mỗi, có thể được đặt trên một mảnh Parafilm (hình 3e,


2 3 4 Kính hiển vi điện tử


F I G U R E 1 từ phân tử để sao chép các phân tử máy--ví dụ về tiêu cực màu chuẩn bị. (a) monome Escherichia coli RNA-polymerase holoenzyme. (b) glutamine synthetase từ E. coli. (Top) Sợi xoắn ốc được hình thành sự hiện diện của số tiền millimolar của Co2§ions. (Phía dưới) Các phân tử nguyên vẹn enzym gồm có 12 giống hệt nhau 50-kDa subunits kết hợp với 622 đối xứng: ví dụ, kết thúc vào xem Hiển thị một điển hình hoa giống như xuất hiện với six-fold đối xứng, trong khi bên xem tiết lộ gấp đôi đối xứng. (c) E. coli bac-teriophage T4: Các tổ chức thành một khác biệt những ellipsoid hình khum icosahedral đầu và một đuôi co xoắn ốc mà một tấm cơ sở với mở rộng sợi được gắn ở phía dưới là hiển nhiên. RNA-polymerase (a) và glutamine synthetase (b) đã được nhuộm màu với 0,75% uranyl formate; và bacterio-phage T4 (c) được nhuộm màu với 1% uranyl axetat. Quy mô bar: 100nm.


Đại F I G U R E 2 sơ diện của một mẫu mô hình "tiêu cực màu". (a) xem sơ đồ đại diện cho một cắt ngang qua một mẫu vật mẫu (ánh sáng màu xám) đã được nhúng trong một lý tưởng tiêu cực vết (tối màu xám). (b) chế độ xem sơ trong một được dự đoán bằng cách thêm các giá trị điểm ảnh dọc theo trục dọc. Cấu hình chiếu của mẫu vật "tiêu cực màu" mô hình được đại diện bởi một dấu vết đen dày, trong khi cấu hình chiếu của mẫu vật "unstained" mô hình được mô tả bởi một dấu vết xám mỏng hơn. Trong trường hợp của các "tiêu cực

màu" mẫu, Hồ sơ chiếu của nó đảo ngược, tức là, nhân với b y - 1, để so sánh trực tiếp với hồ sơ tương ứng của các

"unstained" mẫu.

NEGATIVESTAINING 2 3 5

hình 3 vật liệu và thiết bị cần thiết cho tiêu cực nhuộm. (a) mẫu vật hỗ trợ lưới (ví dụ: 200 lưới /, đồng lưới, 3,05 mm đường kính và cách 0.7 mm dày) tráng với một bộ phim composite collodion-cacbon (phim hỗ trợ là đặc biệt là điều hiển nhiên ở các cạnh). (b) các lưới hỗ trợ mẫu được lưu trữ trên giấy lọc trong một món ăn petri được bảo hiểm (bìa được lấy ra cho rõ ràng). (c) chính xác kẹp với hàm hơi cong trụ được sử dụng cho tất cả các thao tác. (d) các lưới mẫu vật được kết xuất Purifying trong một bầu không khí giảm của không khí bằng cách sử dụng một đơn vị ánh sáng-xả theo đặc thù (cho việc thiết kế, xem Aebi và Pollard, 1987). Lưới mẫu vật là sáng xuất viện ngày một khối thủy tinh nhỏ được bao phủ với Parafilm (xem arrowhead). (e) một miếng kim loại hay khay phục vụ như là "bàn làm việc" cho nhuộm. Nước và vết giọt được đặt trên một mảnh Parafilm bên trái, khối thủy tinh với một mạng lưới phát sáng thải được nhìn thấy bên phải ở phía sau, và một mảnh giấy lọc được mô tả trong front.



3. Phủ định vết, tức là, kim loại nặng giải pháp. Ví dụ,


III. Thủ tục

giải pháp

f o l l o w tôi n g s o l u t tôi o n s là r e q u tôi r e d cho n e g một t tôi v e nhuộm.

mẫu vật giải pháp ~ treo

Deionized hoặc thậm chí tốt hơn, đôi chưng cất nước. W một r e t

là r e q u tôi r e d cho w s h tôi n g c p e s tôi m e n lưới sau

s p e c tôi m e n một d s o r p t tôi o n.


23 6 ELECTRONMICROSCOPY


F I nhuộm G U R E 4 tiêu cực. (a) một giọt N5-bd mẫu giải pháp/hệ thống treo được đặt vào một ánh sáng-thải ra mẫu vật hỗ trợ lưới đó là tổ chức theo chiều ngang bởi một cặp kẹp và có thể adsorb cho 30-60 s. (b) các lưới mẫu vật sau đó quay theo chiều dọc và (c) cho phép để nhẹ nhàng chạm vào giấy lọc, (d) loại bỏ chất lỏng dư thừa. (e) các mẫu vật adsorbed sau đó rửa sạch bằng cách cẩn thận đặt nó sang một bên lên một giọt nước cho tôi s, blotted như minh hoạ trong b-d, và rửa một lần thứ hai. Nhuộm thực tế được thực hiện tương tự như vậy bằng cách đầu tiên rửa lưới mẫu vật trên một giọt tiêu cực vết như được mô tả trong e, blotting và lặp lại-ing bước này một lần nữa, thời gian này để lại lưới điện mẫu vật cho 10s trên giọt tiêu cực vết giải pháp. (f) sau khi blotting ra dư thừa vết, vết còn lại được lấy ra bằng cách nhẹ nhàng di chuyển một mao mạch (rút ra-out và hình từ một pipette Pasteur) xung quanh các cạnh của lưới điện. Mao mạch được kết nối với một thiết bị hút chân không thấp (ví dụ, một máy bơm nước máy bay phản lực).


lọc các giải pháp thông qua một 0,2-~ m màng lọc [e.Project, một Supor 0,2-btm Acrodisc 32 từ khoa học Gelman (www.pall.com)].

Điều chỉnh độ pH để 4,25 bằng cách thêm 10 N NaOH (về

2btl dung dịch tiêu cực vết l l m). Giải pháp formate uranyl nên biến thành một màu vàng cường độ cao vừa phải (thận trọng: pH về hướng trung tính tăng lên nhanh chóng dẫn đến mưa uranyl muối.)

Khuấy cho một 5 phút trong bóng tối.

Lọc một lần thứ hai.

Điều chỉnh âm lượng với đôi chưng cất nước để bù đắp cho mất nước do bay hơi, lọc, vv

Store vết trong bóng tối (ví dụ, trong một ống bọc vào giấy nhôm). Nó sẽ giữ ổn định trong 1-2 ngày.

Lưu ý: Uranyl formate có thể được khó khăn để mua hàng: thử, ví dụ như, www.pfaltzandbauer.com (Pfalz & Bauer Inc, Waterbury, CT 06708).

sinh Staining

Chúng tôi tiêu chuẩn nhuộm thủ tục hòa tan pro-teins và của Hội đồng supramolecular là illus-trated trong hình 4.