2. Materials and methods2.1. Bacter

2. Materials and methods
2.1. Bacterial isolate
Staphylococcus aureus(MRSA 8111), an oxacillin-resistant, gentamicin-sensitive organism isolated from the blood of a patient,
was provided by the Clinical Microbiology Laboratory of the Stratton VAMC.
2.2. Antimicrobial agents and cytokines
Dap was provided by Cubist Pharmaceuticals. Gentamicin (Gen)
and rifampin (Rif) were obtained from Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO. GM-CSF and IFN-cwere obtained from R&D Systems,
Minneapolis, MN.2.3. Antimicrobial susceptibility testing
Antimicrobial susceptibility testing was done using the CLSI-approved macrodilution method M7-A6[10]. MIC’s (lg/ml) were:
Dap 0.5; Gen 2; Rif 0.015.
2.4. Growth and opsonization of bacteria and preparation of
monocytes
These procedures were performed as previously described[11].
Monocytes were obtained from the blood of volunteer donors under a protocol approved by the Institutional Review Board of the
Stratton Veterans Affairs Medical Center.
2.5. Study design
MDM monolayers were prepared as previously described[11].
Following a series of time-kill experiments with different drug
concentrations, the following concentrations were used: Dap –
1MIC, Gen – 0.5MIC, Rif – 1MIC. These concentrations were
chosen to allow detection of the effects of the added cytokines in
the comparative experiments.
For experiments with cytokines, GM-CSF (100 U/lL) or IFN-c
(1000 U/lL) were added after MDM had adhered, incubated at
37C in an atmosphere of 5% CO2for 18 h, and then replaced at
time 0 (i.e., after phagocytosis and washing). Antibiotics were also
added at time 0. Following incubation for 0, 4, 24, or 48 h at 35C,
the medium was removed and MDM monolayers were lysed by the
addition of sterile distilled H2O. Viable bacteria in the lysates were
enumerated using the standard plate count method. For all intracellular experiments, each condition was set up in duplicate (two
wells) and the number of viable bacteria in each lysate was determined in duplicate. Each experiment was performed four times.
2.6. Statistical methods
Analysis of the data, specific for observation hour and for cytokine, used an analysis of variance, two-way cross-classification
with proportional frequencies[12], with the logarithm, base 10,
transformation of observed numbers of CFU/ml. The two factors
were antibiotic treatment with and without the specified cytokine
and replicated experiments. The level of significance was 0.01. Post
hoc tests were made using the Dunn procedure[13]. The results
are presented as the geometric mean number ofS. aureusat the
specified observation hour, expressed as a percent of the geometric
mean number ofS. aureusat time 0 (Table 1A and B) and as the ratios of these percents in the presence/absence of the cytokines
(Fig. 1A and B).

Kết quả (Việt) 1:

2. tài liệu và phương pháp2.1. vi khuẩn isolateStaphylococcus aureus (MRSA 8111), một sinh vật chịu oxacillin, gentamicin-nhạy cảm bị cô lập từ máu của bệnh nhân,được cung cấp bởi các phòng thí nghiệm vi sinh vật học lâm sàng của Stratton VAMC.2.2. kháng khuẩn đại lý và phân bàoDAP được cung cấp bởi Cubist dược phẩm. Gentamicin (Gen)và rifampin (Rif) đã thu được từ công ty hóa chất Sigma, St.Louis, MO GM-CSF và IFN-cwere thu được từ R & D hệ thống,Minneapolis, MN.2.3. Kháng sinh nhạy cảm thử nghiệmKháng sinh nhạy cảm thử nghiệm đã được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp đã phê duyệt CLSI macrodilution M7-A6 [10]. Hanh (lg/ml) là:DAP 0,5; Gen 2; Rif 0.015.2.4. tăng trưởng và opsonization của vi khuẩn và chuẩn bịmonocytesCác thủ tục này được thực hiện như mô tả trước đó [11].Monocytes đã thu được từ máu các nhà tài trợ tình nguyện theo nghị định thư một sự chấp thuận của Hội đồng quản trị xem xét tổ chức của cácTrung tâm y tế Stratton cựu chiến binh giao.2.5. nghiên cứu thiết kếMDM monolayers đã được chuẩn bị như đã mô tả [11].Sau một loạt các thời gian-giết thí nghiệm với loại thuốc khác nhaunồng độ, nồng độ sau đây được sử dụng: Dap-1 MIC, Gen-0,5 MIC, Rif-1 MIC. Các nồng độ đãchọn cho phép phát hiện những ảnh hưởng của phân bào được thêm vào trongcuộc thử nghiệm so sánh.Cho các thí nghiệm với phân bào, GM-CSF (100 U/lL) hoặc IFN-c(1000 U/lL) đã được thêm vào sau khi MDM có tôn trọng, ủ tại37 C trong một bầu không khí của 5% CO2for 18 h, và sau đó thay thế tạithời gian 0 (tức là, sau khi phagocytosis và rửa). Thuốc kháng sinh cũngThêm vào thời điểm 0. Sau ấp cho 0, 4, 24 hoặc 48 h 35 C,Các phương tiện đã được gỡ bỏ và MDM monolayers được phân bằng cácbổ sung các vô trùng cất H2O. Các vi khuẩn khả thi trong các lysates đãliệt kê bằng cách sử dụng phương pháp tính tiêu chuẩn tấm. Cho tất cả các thí nghiệm nội bào, mỗi điều kiện đã được thiết lập trong bản sao (haiWells) và số của các vi khuẩn khả thi trong mỗi lysate được xác định trong bản sao. Mỗi thử nghiệm được thực hiện bốn lần.2.6. thống kê các phương phápPhân tích dữ liệu, cụ thể cho giờ quan sát và cho cytokine, sử dụng một phân tích các phương sai, phân loại đường hai chiềuvới tỷ lệ với tần số [12], với logarit, 10 cơ sở,chuyển đổi của các quan sát số CFU/ml. Hai yếu tốlà điều trị kháng sinh có và không có quy định cytokinevà sao chép thử nghiệm. Tầm quan trọng của mức độ là 0,01. Bài viếthọc thử nghiệm đã được thực hiện bằng cách sử dụng các thủ tục Dunn [13]. Kết quảđược trình bày như hình học có nghĩa là số ofS. aureusat cácchỉ định giờ quan sát, thể hiện như một phần trăm của các hình họccó nghĩa là số ofS. aureusat thời gian 0 (Bảng 1A và B) và là các tỷ lệ của các phần trăm trong sự hiện diện/sự vắng mặt của các phân bào(Hình 1A và B).

Kết quả (Việt) 2:

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vi khuẩn phân lập
vi khuẩn Staphylococcus aureus (MRSA 8111), một, gentamicin nhạy cảm sinh oxacillin chống phân lập từ máu của bệnh nhân,
được cung cấp bởi các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng của Stratton VAMC.
2.2. Tác nhân kháng khuẩn và các cytokine
Dap được cung cấp bởi Lập thể Dược phẩm. Gentamicin (Gen)
và rifampin (Rif) thu được từ Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO. GM-CSF và IFN-cwere thu được từ R & D Systems,
Minneapolis, MN.2.3. Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh
kháng khuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm đã được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp macrodilution CLSI-phê duyệt M7-A6 [10]. MIC của (lg / ml) là:
Dap 0,5; Gen 2; Rif 0.015.
2.4. Tăng trưởng và opsonization của vi khuẩn và sự chuẩn bị của
monocytes
Những thủ tục này được thực hiện như mô tả trước đây [11].
Monocytes được lấy từ máu của những người tình nguyện dưới một giao thức chấp thuận của Hội đồng Xét về thể chế
Trung tâm Y tế Stratton Veterans Affairs.
2.5. Thiết kế nghiên cứu
. MDM lớp đơn đã được chuẩn bị như mô tả trước đây [11]
Sau một loạt các thí nghiệm thời gian-kill với thuốc khác nhau
nồng độ, nồng độ sau đây được sử dụng: Dap -
1 MIC, Gen - 0,5 MIC, Rif - 1 MIC???. Những nồng độ đã được
chọn để cho phép phát hiện những ảnh hưởng của các cytokine được thêm vào trong
các thử nghiệm so sánh.
Đối với thí nghiệm với các cytokine, GM-CSF (100 U / lL) hoặc IFN-c
(1000 U / lL) đã được thêm vào sau khi MDM đã tôn trọng, ủ ở
37? C trong không khí 5% CO2for 18 h, và sau đó thay thế tại
thời điểm 0 (tức là, sau khi thực bào và rửa). Kháng sinh cũng đã được
thêm vào lúc 0. Sau khi ủ trong 0, 4, 24, hay 48 h 35? C,
trung đã được gỡ bỏ và đơn lớp MDM được ly giải bởi các
bổ sung của H2O cất vô trùng. Vi khuẩn tồn tại trong lysates được
liệt kê bằng cách sử dụng phương pháp đếm tấm tiêu chuẩn. Đối với tất cả các thí nghiệm trong tế bào, mỗi điều kiện được thành lập vào trùng lặp (hai
giếng) và số lượng vi khuẩn tồn tại trong mỗi lysate xác định trùng lặp. Mỗi thí nghiệm được thực hiện bốn lần.
2.6. Phương pháp thống kê
phân tích dữ liệu, cụ thể cho giờ quan sát và cho cytokine, sử dụng một phân tích phương sai, hai chiều ngang phân loại
tỷ lệ thuận với tần số [12], với logarit, căn cứ 10,
chuyển đổi các số quan sát của CFU / ml. Hai yếu tố này
là điều trị kháng sinh có và không có các cytokine quy định
và thí nghiệm nhân rộng. Mức ý nghĩa là 0,01. Bài
kiểm tra đột xuất được thực hiện bằng cách sử dụng thủ tục Dunn [13]. Các kết quả
được trình bày như là OFS số trung bình hình học. aureusat những
giờ quan sát được chỉ định, được thể hiện như một phần trăm của hình học
OFS số trung bình. aureusat thời gian 0 (Bảng 1A và B) và là tỷ lệ phần trăm của những sự có mặt / vắng mặt của các cytokines
(Hình 1A và B.).