DNA extraction and Southern blot an

DNA extraction and Southern blot analysis
Genomic DNA was extracted by an improved CTAB method based
on the procedure described by Murray and Thompson (1980). Five
micrograms of DNA of each sample, estimated by agarose gel
staining and fluorimetry after treatment with RNaseA, was digested
with EcoRV (Gibco-BRL, Geithersburg, Md.) in a final volume of
50 ll. The digested DNA was electrophoresed on 1% (w/v) agarose
gels. After electrophoresis, DNA fragments were denatured and
transferred onto a Hybond-N` nylon membrane (Amersham, Arlington
Heights, Ill.) according to the manufacturer’s instructions.
Most of the Xa21 coding region, including the intron sequence
(3.8-kb fragment), from plasmid digested with the same enzyme of
the corresponding blotted DNAs was labeled with a-[32P]-dCTP
using the Rediprime Labeling Kit (Amersham, Arlington Heights,
Ill.) and used as the hybridization probe.
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
The PCR analysis was conducted based on procedures described by
Huang et al. (1997). The PCR reaction mixture contained 50 ng
template DNA, 50 ng of each primer, 0.16 mM dNTPs, 2.1 mM
MgCl2
, 1]PCR buffer (10 mM TRIS pH 8.4, 50 mM KCl), and
1 ¹aq DNA polymerase in a volume of 25 ul. Template DNA was
initially denatured at 94°C for 5 min, followed by 30 cycles of PCR
amplification with the following parameters: a 30-s denaturation at
94°C, a 30-s primer annealing at 55°C, and a 1-min primer extension
at 72°C allowed for completion of primer extension. The amplified
products were electrophoretically resolved on a 1% agarose gel in
1]TAE buffer.
Inoculation
PX071 (race 4) and PX099 (race 6) strains of Xoo were used to
inoculate transgenic T1 plants. The inoculum of each strain was
prepared by incubating the bacteria on Wakimoto’s medium
for 72 h at 30°C, then suspending each pure culture in sterile distilled
water and adjusting the inoculum to about 109 cells per
milliliter.
The transgenic T1 plants were grown in an IRRI containment
greenhouse under the following conditions: 29°C and 85% humidity

Kết quả (Việt) 1:

Khai thác DNA và Southern blot phân tíchGen DNA được chiết xuất bởi một phương pháp cải tiến CTAB dựavề thủ tục được mô tả bởi Murray và Thompson (1980). Nămmicrogram DNA của mỗi mẫu, theo ước tính của agarose gelnhuộm và fluorimetry sau khi điều trị với RNaseA, được tiêu hóavới EcoRV (Gibco-BRL, Geithersburg, Md.) trong một tập cuối cùng của50 ll. Tiêu hóa DNA electrophoresed trên 1% (w/v) agaroseGel. Sau khi điện, mảnh vỡ DNA đã denatured vàchuyển vào một Hybond-N' nylon màng (Amersham, ArlingtonHeights, Ill) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Hầu hết các vùng mã hóa Xa21, bao gồm cả trình tự intron(3.8-kb mảnh), từ plasmid tiêu hóa với enzyme tương tự củablotted tương ứng DNAs đã được dán nhãn với một-[32P]-dCTPsử dụng các Rediprime ghi nhãn Kit (Amersham, Arlington Heights,Ill) và được sử dụng như là các thăm dò lai ghép.Trùng hợp phản ứng dây chuyền (PCR) phân tíchĐảng Cộng sản Romania phân tích được thực hiện dựa trên quy trình được mô tả bởiHoàng et al. (1997). Đảng Cộng sản Romania phản ứng hỗn hợp chứa 50 ngmẫu DNA, 50 ng của mỗi mồi, 0,16 mM dNTPs, 2.1 mMMgCl21] Đảng Cộng sản Romania đệm (10 mM TRIS pH 8.4, 50 mM KCl), và1 ¹aq DNA polymerase trong một tập của 25 ul. Mẫu DNA làBan đầu denatured tại 94° C cho 5 phút, sau đó là các chu kỳ 30 của Đảng Cộng sản RomaniaCác khuếch đại với các thông số sau đây: một 30-s denaturation tại94° C, một mồi 30-s ủ tại 55° C, và một phần mở rộng 1-min mồiở 72° C cho phép để hoàn thành mồi phần mở rộng. Các khuếch đạisản phẩm electrophoretically đã được giải quyết trên một gel agarose 1% trong1] TAE bộ đệm.Tiêm chủngPX071 (chủng tộc 4) và PX099 (chủng tộc 6) chủng Xoo được sử dụng đểtháp cây biến đổi gen T1 nhà máy. Inoculum căng thẳng mỗi làchuẩn bị bởi ấp các vi khuẩn trên trung bình của Wakimotocho 72 h 30° C, sau đó có thể đình chỉ mỗi nền văn hóa tinh khiết trong vô trùng chưng cấtnước và điều chỉnh inoculum để các tế bào khoảng 109 mộtmilliliter.Biến đổi gen T1 cây được trồng ở một ngăn chặn IRRInhà kính theo các điều kiện sau đây: 29° C và 85% độ ẩm

Kết quả (Việt) 2:

Chiết DNA và phân tích Southern blot
ADN hệ gen được chiết xuất bằng phương pháp CTAB cải tiến dựa
trên các thủ tục được mô tả bởi Murray và Thompson (1980). Năm
microgram DNA của mỗi mẫu, theo ước tính của gel agarose
nhuộm và fluorimetry sau khi điều trị với RNaseA, đã được tiêu hóa
với EcoRV (Gibco BRL-, Geithersburg, Md.) Trong một thể tích cuối cùng của
50 ll. Các DNA tiêu hóa được electrophoresed trên 1% (w / v) agarose
gel. Sau khi điện di, các mảnh DNA đã biến tính và
chuyển lên một Hybond-n` nylon màng (Amersham, Arlington
Heights, Ill.) Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hầu hết các XA21 mã hóa khu vực, bao gồm trình tự intron
(đoạn 3,8 kb), từ plasmid tiêu hóa với các enzyme tương tự của
các DNA thấm tương ứng đã được dán nhãn với a- [32P] -dCTP
sử dụng Rediprime nhãn Kit (Amersham, Arlington Heights,
Ill.) và được sử dụng như thăm dò lai.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phân tích
Các phân tích PCR được tiến hành dựa trên các thủ tục được mô tả bởi
Huang et al. (1997). Hỗn hợp phản ứng PCR chứa 50 ng
ADN khuôn, 50 ng của mỗi lớp sơn lót, 0,16 mM dNTP, 2.1 mM
MgCl2, 1] đệm PCR (10 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl), và 1 ¹aq DNA polymerase trong một thể tích 25 ul. Mẫu DNA đã được ban đầu bị biến tính ở 94 ° C trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ PCR khuếch đại với các thông số sau: a 30-s biến tính ở 94 ° C, một ủ 30-s mồi ở 55 ° C, và một 1 mở rộng mồi phút ở 72 ° C cho phép để hoàn thành phần mở rộng mồi. Các khuếch đại các sản phẩm đã được electrophoretically giải quyết trên agarose gel 1% trong 1] TAE buffer. Cấy PX071 (chủng tộc 4) và PX099 (đua 6) chủng Xoo đã được sử dụng để cấy cây T1 chuyển gen. Ổ bệnh của từng chủng đã được chuẩn bị bằng cách ủ vi khuẩn trên môi trường Wakimoto của 72 h ở 30 ° C, sau đó đình chỉ mỗi nền văn hóa trong sạch cất vô trùng nước và điều chỉnh các tác nhân gây bệnh cho khoảng 109 tế bào trên mỗi ml. Các nhà máy T1 chuyển gen được trồng trong một IRRI ngăn chặn hiệu ứng nhà kính theo các điều kiện sau đây: 29 ° C và độ ẩm 85%