A previously described RT-PCR metho

A previously described RT-PCR method4 was modified to
amplify a 716-bp fragment of ORF 5 and part of ORF 4 and
6 (716-bp RT-PCR). The PCR mix was 50 l in volume and
contained reagents in the same concentrations as above, with
the exception that 1.5 mM MgCl2, 0.2 M of each primer,
and 4 l of template were used. Hot start was achieved using
a wax beadi to separate the Taq DNA polymerase from the
rest of the reagents. The RT-PCR cycle parameters were similar
to above except primer extension time was lengthened
to 30 sec. If no amplicon was generated by the 716-bp RTPCR,
a second method was used to amplify a 933-bp region,
including 47 bp upstream to 170 bp downstream of the
above 716-bp fragment (933-bp RT-PCR). The 933-bp RTPCR
was identical to that of 716-bp RT-PCR except for the
primer sequence used, i.e., forward primer 5-GAC ACC
TGA GAC CAT GAG and reverse primer 5-TCT ATG GCT
GAG TAC ACC. After 716-bp RT-PCR or 933-bp RT-PCR,
10 l of product was digested with MluI, HincII, and SacII
separately at 37 C for 2 hr as described by the manufacturer.j
The samples were electrophoresed through a 2% highstrength
agarosek gel and visualized by staining with ethidium
bromide. Fragment size was determined against a 100-
bp DNA ladder

Kết quả (Việt) 1:

Method4 RT-PCR được mô tả trước đó được cải biến đểkhuyếch đại một mảnh 716-bp ORF 5 và một phần của ORF 4 và6 (716-bp RT-PCR). PCR mix là 50 l trong khối lượng vàchứa hoá chất ở các nồng độ tương tự như trên, vớingoại lệ là 1,5 mM MgCl2, cách 0.2 M mỗi mồi,và 4 l của mẫu đã được sử dụng. Bắt đầu nóng đã đạt được bằng cách sử dụngbeadi sáp để tách Taq DNA polymerase từ cácphần còn lại của các chất phản ứng. RT-PCR chu kỳ các thông số đều tương tự nhưđể ở trên trừ mồi mở rộng thời gian được kéo dàiđến 30 giây. Nếu không có amplicon đã được tạo ra bởi RTPCR 716-bp,phương pháp thứ hai được sử dụng để khuếch đại vùng 933-bpbao gồm 47 bp ngược dòng để 170 bp hạ lưu của cáctrên 716-bp đoạn (933-bp RT-PCR). RTPCR 933-bplà giống hệt nhau của 716-bp RT-PCR ngoại trừ cho cáctrình tự mồi được sử dụng, tức là chuyển tiếp mồi 5 - GẤC ACCTGA GẤC CAT GAG và đảo ngược mồi 5 - TCT ATG GCTGAG TAC ACC Sau khi 716-bp RT-PCR hoặc 933-bp RT-PCR,10 l của sản phẩm được tiêu hóa với MluI, HincII và SacIIriêng ở 37 C cho 2 nhân sự như được mô tả bởi manufacturer.jCác mẫu được electrophoresed thông qua một highstrength 2%agarosek gel và hình dung bởi nhuộm với ethidiumbromua. Kích thước mảnh đã được xác định đối với một 100-BP DNA bậc thang

Kết quả (Việt) 2:

Một method4 RT-PCR được mô tả trước đây đã được sửa đổi để
khuếch đại một đoạn 716 bp của ORF 5 và một phần của ORF 4 và
6 (716-bp RT-PCR). Các hỗn hợp PCR là 50 l khối lượng và
chứa chất thử trong cùng nồng độ như trên, với
ngoại lệ là 1.5 mM MgCl 2, 0,2 M của mồi,
và 4 lít của mẫu đã được sử dụng. Bắt đầu nóng đã đạt được sử dụng
một beadi sáp để tách các polymerase Taq DNA từ
phần còn lại của thuốc thử. Các thông số chu trình RT-PCR là tương tự như
ở trên ngoại trừ thời gian gia hạn mồi được kéo dài
đến 30 giây. Nếu không có amplicon được tạo ra bởi các RTPCR 716-bp,
một phương pháp thứ hai được sử dụng để khuếch đại một vùng 933-bp,
bao gồm 47 bp thượng nguồn đến 170 bp hạ lưu
trên đoạn 716 bp (933-bp RT-PCR).
Các RTPCR 933-bp giống hệt như 716-bp RT-PCR trừ các
chuỗi mồi được sử dụng, ví dụ, về phía trước mồi 5? -GAC ACC
TGA GAC CAT GAG và đảo ngược mồi 5? -TCT ATG GCT
GAG TAC ACC. Sau 716-bp RT-PCR hoặc 933-bp RT-PCR,
10 l của sản phẩm đã được tiêu hóa với MluI, HincII, và SacII
riêng ở 37 C trong 2 giờ như mô tả của manufacturer.j
Các mẫu được electrophoresed qua 2% highstrength
agarosek gel và hình dung bằng cách nhuộm với ethidium
bromide. Kích thước mảnh được xác định đối với một 100-
thang DNA bp mong mồi 5? -GAC ACC TGA GAC CAT GAG và đảo ngược mồi 5? -TCT ATG GCT GAG TAC ACC. Sau 716-bp RT-PCR hoặc 933-bp RT-PCR, 10 l của sản phẩm đã được tiêu hóa với MluI, HincII, và SacII riêng ở 37 C trong 2 giờ như mô tả của manufacturer.j Các mẫu được electrophoresed qua 2% highstrength agarosek gel và hình dung bằng cách nhuộm với ethidium bromide. Kích thước mảnh được xác định đối với một 100- thang DNA bp mong mồi 5? -GAC ACC TGA GAC CAT GAG và đảo ngược mồi 5? -TCT ATG GCT GAG TAC ACC. Sau 716-bp RT-PCR hoặc 933-bp RT-PCR, 10 l của sản phẩm đã được tiêu hóa với MluI, HincII, và SacII riêng ở 37 C trong 2 giờ như mô tả của manufacturer.j Các mẫu được electrophoresed qua 2% highstrength agarosek gel và hình dung bằng cách nhuộm với ethidium bromide. Kích thước mảnh được xác định đối với một 100- thang DNA bp

Kết quả (Việt) 3:

Trước RT-PCR miêu tả cách tiến hành cải tiến716 khuếch đại ca ORF 4 và 5 và ORF6 (716 ca RT-PCR).Sự kết hợp của PCR cho khối lượng và 50 LVới trên cùng chứa nồng độ thuốc thửTrừ 1,5 mm clorua magiê, 0.2 mét mỗi đoạn mồi,Và 4 L mẫu.Khởi động thực hiện được dùng nóng.Sáp beadi tách Taq DNA polymerase từPhần còn lại của thuốc thử.Chu trình RT-PCR tham số giốngKéo dài thời gian ngoài trừ mồi- 30 giây.Nếu không có những 716 khuếch đại ca RT-PCR tạo ra,Cách thứ hai là dùng để khuếch đại một 933 vùngBao gồm 47 đến 170 ở thượng nguồn đến hạ lưuTrên 716 mảnh DNA (933 ca ca RT-PCR).Phương pháp 933 BPNgoại trừ ca cũng là 716 PCRChuỗi mồi, tức là mồi của 5-GAC ACCTGAName GAC mèo Gag 5-tct ATG GCT mồi và ngược lại.Một trò đội 716 ca ca và 933 ACC phát hiện sau khi RT-PCR,L MluI 10 cho sản phẩm, dầu tiêu hóa, và SacIIRiêng biệt ở 37 C cho 2 tiếng, được mô tả bởi nhà sản xuất.Qua hai mẫu điện cường độ caoAgarosek gel và hiển thị và nhuộmBrom.Mảnh vỡ với một kích thước chắc chắn 100...Ca thang DNA