LC-MS/MS procedureA Sciex API-3000

LC-MS/MS procedure
A Sciex API-3000 LC-MS/MS instrument (Applied biosystems
division of MDS health group Ltd, Canada) was
used for analysis together with an autosampler (PALCTC
Analytics, Switzerland), and turbomolecular pump
(1100 series, Agilent Technologies, USA). Analyst software
version 1.4.2 (AB Sciex) was used for data analyses.
A 10 μL aliquot of the sample was injected into the LCMS/MS
system for analysis in low light conditions. An
Ultrason ES-OVM chiral column (2 mm × 150 mm,
5 μm) was used in tandem with an Agilent rapid resolution
microbore Zorbax SB-C18 RRHD column
(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) with corresponding inlet filters
for guarding the columns.
The column oven temperature was maintained at
40°C. However, the column switching programme was
set in a way so that the column temperature switch from
right to left after 8 minutes and then switch back to
right after 13 minutes with a temperature tolerance of
±1°C. The use of switching temperatures technique
resulted in good separation, better peak shape and reproducibility.
Various mobile phases and differing gradient
compositions were explored for optimal results with
the final selected parameters as follows. Mobile phases
A consisted of acetonitrile (100%) with 0.3% (v/v) formic
acid and B containing 0.1% (v/v) formic acid and ammonium
acetate (2 mM) with a flow rate in all steps at
0.2 mL/min. The gradient program was as follows: initial:
35% B; 0–4.0 min: a gradient change to 98% A; from
4.0–10 min: kept at 98% A; from 10–14 min: reversion
of the mobile phase to 35% B; 14.1–20.0 min; 35% B.
The mass spectrometer was auto-equilibrated for
0.5 min. The channel electron multiplier (CEM) detector
was set to 3290 eV with a deflection of 400. The mass
spectrometer parameters like deflection potential, focussing
potential, energy potential and collision cell exit potential
was optimised for each analyte. The mass
spectrometer was set to run three periods sequentially
with optimised conditions for selected analytes. The total
run time for mass spectrometer was 20 minutes. First
period was run for 8 minutes with optimum conditions
for 1α25(OH)2D3 and 1α25(OH)2D2 and stanozolol-d3
internal standard followed by second period for 5 minutes
with optimised conditions for 25OHD3, 25OHD2, 3-epi-
25OHD3, 3-epi-25OHD2 and 7αC4 and a 3rd period was
employed for a final 7 minutes for determination of vitamin
D3 and vitamin D2. The mass spectrometer was
operated in positive electrospray ionisation (ESI) mode at
an average spray voltage of 4500 V and average capillary
temperature of 450°C between the three periods. The
generated protonated molecules of all analytes were used
as precursor ions for collision activated dissociation
(CAD) into product ions in MS-MS analysis.

Kết quả (Việt) 1:

Thủ tục LC-MS/MSMột công cụ Sciex API-3000 LC-MS/MS (biosystems ứng dụngbộ phận của MDS sức khỏe group Ltd, Canada) làđược sử dụng để phân tích cùng với một autosampler (PALCTCAnalytics, Thụy sĩ), và máy bơm turbomolecular(1100 loạt, Agilent công nghệ, Hoa Kỳ). Chuyên viên phân tích phần mềmPhiên bản 1.4.2 (AB Sciex) được sử dụng để phân tích dữ liệu.Một aliquot 10 μL của mẫu đã được tiêm vào LCMS/MSHệ thống cho các phân tích trong điều kiện ánh sáng yếu. MộtUltrason ES-OVM chiral cột (2 mm × 150 mm,5 μm) đã được sử dụng song song với độ phân giải nhanh chóng Agilentmicrobore Zorbax SB-C18 RRHD cột(2.1 mm × 100 mm, 1,8 μm) với tương ứng đầu vào bộ lọcđể bảo vệ các cột.Nhiệt độ lò nướng cột được duy trì ở40° C. Tuy nhiên, các cột chuyển đổi chương trình làthiết lập một cách để cột nhiệt độ chuyển đổi từngay bên trái sau khi 8 phút và sau đó chuyển trở lạingay sau khi 13 phút với khả năng chịu nhiệt độ của±1 ° C. Việc sử dụng các chuyển đổi nhiệt độ kỹ thuậtkết quả tốt tách, hình dạng đỉnh cao tốt hơn và reproducibility.Các điện thoại di động giai đoạn khác nhau và các gradient khác nhautác phẩm đã được khám phá cho kết quả tối ưu vớitrận chung kết các tham số lựa chọn như sau. Điện thoại di động giai đoạnA bao gồm acetonitrile (100%) với formic 0,3% (v/v)axit và B có chứa axit formic 0,1% (v/v) và amoniaxetat (2 mM) với một tốc độ dòng chảy trong tất cả các bước tạicách 0.2 mL/phút. Chương trình gradient là như sau: ban đầu:35% B; 0-4,0 phút: một biến đổi gradient để 98% A; từ4,0-10 phút: giữ tại 98% A; từ 10-14 phút: nổitrong giai đoạn di động để 35% B; 14,1-20,0 min; 35% SINHMáy đo phổ khối lượng là tự động equilibrated chocách 0.5 min. Các máy dò điện tử nhân (CEM) Kênhđã được thiết lập để 3290 eV với một độ lệch của 400. Khối lượngMáy đo phổ thông số như độ lệch tiềm năng, tập trungtiềm năng, năng lượng tiềm năng và va chạm tế bào thoát khỏi tiềm năngđược tối ưu hóa cho mỗi analyte. Khối lượngquang phổ đã được thiết lập để chạy ba giai đoạn tuần tựvới điều kiện tối ưu hóa cho đã chọn analytes. Tổng sốChạy thời gian cho máy đo phổ khối lượng là 20 phút. Đầu tiênthời gian chạy 8 phút với điều kiện tối ưucho 1α25 (OH) 2D 3 và 1α25 (OH) 2D 2 và stanozolol-d3nội bộ tiêu chuẩn theo các giai đoạn thứ hai trong 5 phútvới các điều kiện tối ưu hóa cho 25OHD3, 25OHD2, 3-epi -25OHD3, 3-epi-25OHD2 và 7αC4 và một thứ 3 giai đoạn làlàm việc cho một trận chung kết 7 phút để xác định vitaminTuyến đường D3 và vitamin D2. Máy đo phổ khối lượng làhoạt động trong chế độ electrospray tích cực ion (ESI)Trung bình phun điện áp của 4500 V và trung bình mao mạchnhiệt độ 450° C giữa ba giai đoạn. Cáctạo ra protonated các phân tử của analytes tất cả đã được sử dụngnhư là tiền thân của các ion cho va chạm kích hoạt phân ly(CAD) vào sản phẩm ION trong MS-MS phân tích.

Kết quả (Việt) 2:

LC-MS / MS thủ tục
A Sciex API-3000 LC-MS / MS cụ (Áp dụng hệ thống sinh học
phân nhóm sức khỏe MDS Ltd, Canada) đã được
sử dụng để phân tích cùng với một mẫu tự động (PALCTC
Analytics, Thụy Sĩ), và bơm phân tử
(1100 loạt , Agilent Technologies, USA). Phần mềm nhà phân tích
phiên bản 1.4.2 (AB Sciex) đã được sử dụng để phân tích dữ liệu.
Một số chia hết 10 ml mẫu được tiêm vào LCMS / MS
hệ thống để phân tích trong điều kiện ánh sáng thấp. Một
cột chiral Ultrason ES-OVM (2 mm × 150 mm,
5 micron) đã được sử dụng song song với một Agilent nhanh chóng giải quyết
microbore Zorbax SB-C18 RRHD cột
(2,1 mm × 100 mm, 1.8 mm) với bộ lọc đầu vào tương ứng
cho canh cột.
Cột nhiệt độ lò đã được duy trì ở mức
40 ° C. Tuy nhiên, các chương trình chuyển đổi cột đã được
thiết lập một cách để chuyển đổi nhiệt độ cột từ
phải sang trái ở phút thứ 8 và sau đó chuyển về
phải ở phút thứ 13 với một khả năng chịu nhiệt độ
± 1 ° C. Việc sử dụng các kỹ thuật chuyển mạch nhiệt độ
dẫn đến tách tốt, hình dạng đỉnh tốt hơn và khả năng tái.
Giai đoạn di động khác nhau và độ dốc khác nhau
tác phẩm đã được khảo sát cho kết quả tối ưu với
các thông số cuối cùng được lựa chọn như sau. Giai đoạn di động
A gồm acetonitrile (100%) với 0,3% (v / v) formic
acid và B chứa 0,1% (v / v) axit formic và ammonium
acetate (2 mM) với tốc độ dòng chảy trong tất cả các bước ở
0.2 mL / min. Các chương trình Gradient như sau: ban đầu:
35% B; 0-4,0 phút: một sự thay đổi độ dốc đến 98% A; từ
4,0-10 min: giữ ở 98% A; 10-14 phút: sự trở lại
của pha động đến 35% B; 14,1-20,0 min; 35% B.
Các khối phổ được tự động được cân bằng cho
0,5 phút. Các nhân kênh electron (CEM) phát hiện
được thiết lập để 3290 eV với trội của 400. Khối lượng
các thông số phổ kế như tiềm năng lệch, tập trung
tiềm năng, tiềm năng năng lượng và tiềm năng xuất cảnh di va chạm
đã được tối ưu hóa cho từng phân tích. Khối
phổ kế được thiết lập để chạy ba giai đoạn tuần tự
với các điều kiện tối ưu cho chất phân tích lựa chọn. Tổng
thời gian chạy cho khối phổ kế là 20 phút. Đầu tiên
thời gian được chạy trong 8 phút với điều kiện tối ưu
cho 1α25 (OH) 2D3 và 1α25 (OH) 2d2 và stanozolol-d3
tiêu chuẩn nội bộ theo sau giai đoạn thứ hai trong 5 phút
với điều kiện tối ưu cho 25OHD3, 25OHD2, 3-đề từ,
25OHD3, 3 -epi-25OHD2 và 7αC4 và một giai đoạn thứ 3 được
sử dụng cho thức một phút 7 để xác định vitamin
D3 và vitamin D2. Các khối phổ kế được
hoạt động trong ion hóa electrospray (ESI) chế độ tích cực tại
một điện áp phun trung bình của 4500 V và mao quản trung bình
nhiệt độ 450 ° C giữa ba giai đoạn. Các
phân tử proton tạo của tất cả các chất phân tích được sử dụng
như là tiền thân cho các ion va chạm kích hoạt phân ly
(CAD) thành các ion sản phẩm trong MS-MS phân tích.