COMMITTING STEP – TAXA-4(5),11(12)-

COMMITTING STEP – TAXA-4(5),11(12)-DIENE
SYNTHASE (TDS)
The committing step in taxoid synthesis is the cyclization
of geranylgeranyl diphosphate to taxadiene, catalyzed by
taxadiene synthase (TDS) (Hezari et al., 1995) (Figure 2).
Attempts to isolate TDS from Taxus trees yielded an
enzyme with a molecular mass of ~79 kDa (Hezari et al.,
1995). Its properties were similar to other plant terpene
synthases, such as a relatively low Km
and Mg
2+
as the
cofactor, but unusually the optimum pH was 8.5. The
main product of the enzyme was confirmed as taxa-4(5),11(12)-diene (Koepp et al., 1995), even though
chemical analysis predicted preferential formation of the 4(20)-11(12)-isomer (Harrison et al., 1966, Guéritte-Voegelein et al., 1987). A 2586-bp cDNA clone encoding
a 98-kDa pre-protein was isolated by a homology-based
PCR cloning strategy (Wildung and Croteau, 1996). The
corresponding enzyme contained an N-terminal plastidial
targeting sequence, which was cleaved after import into
the plastid, although the exact length of this sequence
remains unclear. Heterologous expression of pseudoma-ture, N-terminally truncated TDS variants in E. coli have
indicated a sequence length of up to 79 amino acid
residues (Williams et al., 2000b). Further analysis
revealed features typical of plant terpene synthases, such
as a DDXXD-motif responsible for cofactor binding, a
conifer diterpene internal sequence domain and a
glycosyl hydroxylase-like domain (Trapp and Croteau,
2001). In feeding experiments with the natural substrate
GGPP, the enzyme produced 94% taxa-4(5),11(12)-diene, 5% taxa-4(20),11(12)-diene, 1% verticillene and
trace amounts of the tentatively identified 3(4),11(12)
isomer (Williams et al., 2000b).
Several investigations have focused on the mechanism
of the TDS catalyzed cyclization reaction (Lin et al., 1996;
Williams et al., 2000b; Jin et al., 2005a, b). The proposed
mechanism for the cyclization reaction is shown in Figure
2. The reaction starts with ionization of the all-trans
geranylgeranyl diphosphate ester at the C1 position,
which promotes carbon-carbon bond formation between
the C1 and C14 position of the substrate. This is followed
by closure of the A-ring via a re-face attack at C10,
yielding the 12-verticillyl cation intermediate.
Intramolecular 11 to 7 proton transfer then generates
1S-verticillene (Williams et al., 2000b). The bound
intermediate is rapidly reprotonated at the C7 position,
via the same enzyme base responsible for the earlier
deprotonation (Lin et al., 1996), to initiate transannular
cyclization to generate the taxenyl cation. Finally,
deprotonation at the
-face of C5 of the 4-taxenyl cation
yields the endocyclic 4,5 double bond (Jin et al., 2005a).
Minor pathways involve proton abstraction at the C20 and
C3  positions of the 4-taxenyl cation, yielding taxa-4(20),11(12)-diene and taxa-3(4),11(12)-diene, respec-tively (Jin et al., 2005a). Incubations of TDS with related
macrocyclic diterpenes, cemberene A and verticillene, did
not result in taxa-4(5),11(12)-diene (Lin et al., 1996),
suggesting that partially cyclized intermediates remain
tightly bound to the active site and no exchange with
exogenous additives can occur during the catalytic cycle.
A possible alternative cyclization mechanism of TDS in
which the C-ring is formed first was ruled out based on
the lack of incorporation of deuterium-labeled 2,7-cyclo-geranylgeranyl diphosphate into taxadiene (Williams et
al., 2000b).
As with GGPPS, time course experiments were carried
out with induced Taxus cell cultures. This showed that no
taxadiene and no early intermediates accumulated,
indicating that the cyclization reaction is very slow although taxadiene synthase does not seem to be the
rate limiting factor (Koepp et al., 1995; Hefner et al.,
1996; Hezari et al., 1997).

Kết quả (Việt) 1:

CAM KẾT CÁC BƯỚC-ĐƠN VỊ PHÂN LOẠI-4 (5), 11 (12)-DIENETRỰC KHUẨN ĐẠI TRÀNG (TDS)Bước cam trong tổng hợp taxoid là cyclizationcủa geranylgeranyl diphosphate để taxadiene, xúc tác bởitaxadiene trực khuẩn đại tràng (TDS) (Hezari và ctv., 1995) (hình 2).Những nỗ lực cô lập TDS từ Taxus cây mang lại mộtmen tiêu hóa với một khối lượng phân tử của ~ 79 kDa (Hezari và ctv.,Năm 1995). thuộc tính của nó đã được tương tự như terpene thực vật khácsynthases, chẳng hạn như một Km tương đối thấpvà Mg2 +như cáccofactor, nhưng bất thường pH tối ưu là 8.5. CácCác sản phẩm chính của enzyme được xác nhận là đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene (Koepp et al., 1995), mặc dùphân tích hóa học dự đoán các hình thành ưu đãi của 4 (20)-11 (12)-đồng phân (Harrison và ctv., 1966, Guéritte-Voegelein et al., 1987). Một bản sao 2586-bp cDNA mã hóamột protein trước 98-kDa đã được cô lập bởi một dựa trên tính tương đồngĐảng Cộng sản Romania nhân bản chiến lược (Wildung và Croteau, 1996). Cáctương ứng enzym có một N-ga plastidialnhắm mục tiêu theo trình tự, mà cảm sau khi nhập khẩu vàoplastid, mặc dù chiều dài chính xác của chuỗi nàyvẫn chưa rõ ràng. Heterologous biểu hiện của pseudoma-ture, N-nan y cắt ngắn các biến thể TDS trong E. coli cóchỉ định một chiều dài chuỗi axit amin lên đến 79dư lượng (Williams và ctv., 2000b). Tiếp tục phân tíchtiết lộ tính năng điển hình của thực vật terpene synthases, như vậynhư là một DDXXD-motif chịu trách nhiệm cho cofactor ràng buộc, mộtthực vật hạt trần diterpen nội bộ chuỗi miền và mộtglycosyl giống như prolyl miền (Trapp và Croteau,Năm 2001). trong cho ăn các thí nghiệm với bề mặt tự nhiênGGPP, sản xuất enzyme 94% đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene, 5% đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene, 1% verticillene vàvết của 3(4),11(12) không chắc chắn được xác địnhđồng phân (Williams và ctv., 2000b).Một vài điều tra đã tập trung vào các cơ chếcủa các TDS xúc tác phản ứng cyclization (Lin et al., 1996;Williams et al., 2000b; Jin et al., 2005a, b). Đề xuấtcơ chế phản ứng cyclization sẽ được hiển thị trong hình2. phản ứng bắt đầu với các ion hóa của tất cả-transgeranylgeranyl diphosphate ester tại vị trí C1,mà khuyến khích sự hình thành trái phiếu cacbon-cacbon giữavị trí C1 và C14 của bề mặt. Tiếp theo làbởi đóng cửa của A-ring thông qua một cuộc tấn công lại phải đối mặt nhất tại C10,năng suất cation 12-verticillyl trung gian.Intramolecular 11-7 proton chuyển sau đó tạo ra1s-verticillene (Williams và ctv., 2000b). Ràng buộcTrung gian là nhanh chóng reprotonated tại vị trí C7,Via enzym cùng một cơ sở chịu trách nhiệm về trước đódeprotonation (Lin et al., 1996), để bắt đầu transannularcyclization để tạo ra cation taxenyl. Cuối cùng,deprotonation-khuôn mặt của C5 của cation 4-taxenylsản lượng trái phiếu đôi endocyclic 4,5 (Jin và ctv., 2005a).Con đường nhỏ liên quan đến proton trừu tượng lúc C20 vàC3 các vị trí của cation 4-taxenyl, năng suất đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12)-diene và các đơn vị phân loại-3 (4), 11 (12)-diene, respec-cách (Jin et al., 2005a). Incubations của TDS với liên quanmacrocyclic diterpenes, cemberene A và verticillene, đã làmkhông có kết quả trong đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12)-diene (Lin et al., 1996),cho thấy rằng một phần cyclized trung gian vẫn cònràng buộc chặt chẽ để hoạt động và không có trao đổi vớingoại sinh chất phụ gia có thể xảy ra trong chu kỳ chất xúc tác.Một cơ chế có thể thay thế cyclization TDS trongvành C được hình thành Ban đầu được cai trị dựa trênthiếu sự kết hợp của đơteri có nhãn 2,7-cyclo-geranylgeranyl diphosphate thành taxadiene (Williams etAl., 2000b). Như với GGPPS, thời gian khóa học thí nghiệm đã được tiến hànhra với gây ra Taxus di động văn hóa. Điều này cho thấy rằng không cótaxadiene và không có trung gian đầu tích lũy,chỉ ra rằng phản ứng cyclization là rất chậm mặc dù trực khuẩn đại tràng taxadiene không có vẻ để cáctỷ lệ yếu tố hạn chế (Koepp et al., 1995; Hefner et al.,năm 1996; Hezari et al., 1997).

Kết quả (Việt) 2:

PHẠM STEP - đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -DIENE
synthase (TDS)
Bước phạm trong tổng hợp taxoid là tạo vòng
của geranylgeranyl diphosphate để taxadiene, xúc tác bởi
taxadiene synthase (TDS) (Hezari et al., 1995) (Hình 2).
Những nỗ lực để cô lập TDS từ cây Taxus mang lại một
enzyme có khối lượng phân tử của ~ 79 kDa (Hezari et al.,
1995). Tính chất của nó cũng tương tự như terpene thực vật khác
synthases, chẳng hạn như một Km tương đối thấp
và Mg
2+
là
đồng yếu tố, nhưng khác thường pH tối ưu là 8,5. Các
sản phẩm chính của enzyme đã được xác nhận là đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -diene (Koepp et al., 1995), mặc dù
phân tích hóa học dự đoán hình ưu đãi của 4 (20) -11 (12) - đồng phân (Harrison et al., 1966, Guéritte-Voegelein et al., 1987). Một bản sao cDNA 2586-bp mã hóa
98-kDa pre-protein được cô lập bằng một tương đồng dựa trên
chiến lược nhân bản PCR (Wildung và Croteau, 1996). Các
enzyme tương ứng chứa một plastidial N-terminal
nhắm mục tiêu theo thứ tự, mà được cắt sau khi nhập khẩu vào
các plastid, mặc dù chiều dài chính xác của dãy này
vẫn chưa rõ ràng. Biểu hiện dị của pseudoma-ture, biến thể TDS N-nan cắt ngắn trong E. coli đã
chỉ ra một chuỗi dài lên tới 79 axit amin
dư lượng (Williams et al., 2000b). Phân tích sâu hơn
cho thấy tính chất đặc trưng của synthases terpene vật, chẳng hạn
như một DDXXD-motif chịu trách nhiệm cho đồng yếu tố ràng buộc, một
hạt trần diterpene miền chuỗi nội bộ và một
miền hydroxylase-như glycosyl (Trapp và Croteau,
2001). Trong thí nghiệm cho ăn với các chất tự nhiên
GGPP, các enzyme được sản xuất 94% đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -diene, 5% đơn vị phân loại-4 (20), 11 (12) -diene, 1% verticillene và
một lượng của dự xác định 3 (4), 11 (12)
đồng phân (Williams et al, 2000b.).
Một số điều tra đã tập trung vào các cơ chế
của TDS xúc tác phản ứng tạo vòng (Lin et al, 1996;.
Williams et al, 2000b. ;. Jin et al, 2005a, b). Các đề xuất
cơ chế cho các phản ứng tạo vòng được thể hiện trong hình
2. Phản ứng bắt đầu với ion hóa của tất cả các-trans
ester geranylgeranyl diphosphate ở vị trí C1,
thúc đẩy hình thành liên kết carbon-carbon giữa
C1 và C14 vị trí của bề mặt. Điều này được theo sau
bởi việc đóng cửa của A-ring qua một cuộc tấn công tái mặt tại C10,
năng suất các cation 12-verticillyl trung gian.
Nội phân tử 11? đến 7? chuyển proton sau đó tạo
1S-verticillene (Williams et al., 2000b). Các ràng buộc
trung gian đang nhanh chóng reprotonated ở vị trí C7,
thông qua các cơ sở enzyme cùng chịu trách nhiệm về trước
deprotonation (Lin et al 1996.,), Để bắt đầu transannular
tạo vòng để tạo ra các cation taxenyl. Cuối cùng,
deprotonation tại -face? C5 của cation 4 taxenyl
sản lượng các endocyclic 4,5 liên kết đôi (Jin et al., 2005a).
Con đường nhỏ liên quan đến proton trừu tượng ở C20 và
C3? vị trí của các cation 4 taxenyl, năng suất taxa-4 (20), 11 (12) -diene và đơn vị phân loại-3 (4), 11 (12) -diene, respec-cực (Jin et al., 2005a). Incubations của TDS với liên quan
diterpenes macrocyclic, cemberene A và verticillene, đã
không dẫn đến đơn vị phân loại-4 (5), 11 (12) -diene (Lin et al., 1996),
cho thấy rằng trung gian một phần cyclized vẫn
bị ràng buộc chặt chẽ với các hoạt động trang web và không có trao đổi với
phụ gia ngoại sinh có thể xảy ra trong suốt chu trình xúc tác.
Một cơ chế tạo vòng thay thế có thể có của TDS trong
đó C-ring được tạo đầu tiên đã được loại trừ dựa trên
sự thiếu kết hợp của deuterium-dán nhãn 2,7-cyclo-geranylgeranyl diphosphate vào taxadiene (Williams et
al., 2000b).
Như với GGPPS, thí nghiệm thời gian khóa học đã được thực
hiện với gây nuôi cấy tế bào Taxus. Điều này cho thấy rằng không có
taxadiene và không có trung gian sớm tích lũy được,
chỉ ra rằng các phản ứng tạo vòng là rất chậm mặc dù taxadiene synthase dường như không phải là
yếu tố giới hạn tốc độ (Koepp et al, 1995;. Hefner et al,.
1996; Hezari et al. , 1997).