Amplification ofS-RNasealleles in wi

Amplification of
S
-
RNase
alleles in wild potato
species
Nested PCR assay—with C1FD–C4RD primers in the
first round of amplification and C2F–C4RD or C2F–
C3R primers in the second round—was performed to
amplify and characterize
S
-
RNase
alleles in
S.
chac-
oense
populations,
yielding
distinguishable
PCR
fragments (Fig. 2b, c) whose sizes resembled those
of the known
S
-
RNase
alleles (Table 4). Thus,
S11-
and
S16
-
RNase
alleles yielded C2–C4 amplicons of
373
and 367 bp, respectively (Fig. 2b) and C2–C3
amplicons of 295 and 286 bp, respectively (Fig. 2c).
Different patterns of amplified PCR fragments were
determined between and within
S.
chacoense
acces-
sions, suggesting that these primer pair combinations
were suitable to demonstrate
S
-
RNase
gene variability
in
S.
chacoense
accessions. Notwithstanding, identical
PCR product patterns were detected for genotypes of
PI458314 and QBCM accessions that carried different
S
-
RNase
alleles
(
S11
-
and
S16
-
RNase
alleles
in
plants P3 and Q1, respectively (Fig. 2b, c). This was
interpreted to mean that nested PCR assay alone was
not enough to unravel the
S
-
RNase
gene variability
that remained cryptic.
To check whether the usage of the nested primers
could
be
extended
to
other
wild
potato
species
besides
S.
chacoense
, two accessions of
S.
spegazzi-
nii
and
S.
kurtzianum
were analyzed. Interestingly,
nested
primers
amplified
PCR
products
in
these
species
(Fig. 2b,
c)
suggesting
that
not
only
S
-
RNase
alleles of
S.
chacoense, S. spegazzinii
and
S.
kurtzianum
species shared conserved sequences
but also the sizes of their amplified fragments were
similar. The comparison of the performance of the
different primer pair combinations in the three wild
potato species revealed that the C2F–C3R nested
primer combination was responsible for the best
overall amplification (Fig. 2c).
Discrimination of
S
-RNase alleles in wild potato
species by SSCP analysis
SSCP analysis separated the PCR products obtained
with the C2F–C3R nested primers generating different
banding patterns for the
S
-
RNase
gene (Fig. 3). In
S.
ab
S
PT
PG
PT
O
S
Fig. 1
Pollen–pistil relationships analyzed by fluorecence
microscopy.
a
Compatible: normal growth of pollen tubes along
the style and among the ovules.
b
Incompatible: inhibition of
pollen tube growth in the upper part of the style. (A schematic
view
of
the
pistil
showing
the
region
observed
in
each
photograph is included.
O
ovule,
PG
pollen grain,
PT
pollen
tube,
S
style)
Euphytica (2012) 187:19–29
23
123



chacoense,
two different patterns were determined
within PI458314 accession (Fig. 3, plants P1–P5),
suggesting the existence of another allele besides the
S11
-
RNase
allele. The potato plant carrying the
S16
-
RNase
allele (Fig. 3, plant Q1) showed a unique
pattern that was different from the one exhibited by the
other plants of the accession. As expected, highly
significant
S
-
RNase
gene variability was determined
within QBCM accession (Fig. 3, plants Q1–Q13) in
accordance with the elevated level of pollen–pistil
M
P1
P3
Q6
Q9
Q3
Q1
Q5
K1
K2
K6
K7
O1
O2
O6
O7
intron
C4RD
C3R
C1FD
C2F
C1
C2
C3
C4
C5
HV
a
b
c
S. chacoense
S. spegazzinii
S. kurtzianum
450 bp
400 bp
350 bp
~ 405
~ 370
S11- allele
373bp
S16- allele
367bp
M
P1
P4
P3
P5
P2
Q6
Q9
Q3
Q1
Q5
Q4
K1
K2
K6 K7
O1 O2 O6 O7
350 bp
300 bp
S11- allele
295bp
S16- allele
286bp
S. chacoense
S. spegazzinii
S. kurtzianum
~ 330
~ 290
Fig. 2
Solanum S
-
RNase
gene.
a
Diagram showing locations
of conserved regions (
C
),
hypervariable region (
HV
),
and intron,
and position of primers designed in this work (not to scale).
b
PCR amplification of
S.
chacoense
(two and five plants of
accessions PI458314 and QBCM, respectively),
S.
spegazzinii
(two plants of each accession) and
S.
kurtzianum
(two plants of
each accession) with nested primers C2F–C4RD. M stands for
DNA size markers/50 bp ladder.
c
PCR amplification of
S.
chacoense
(five and six plants of accessions PI458314 and
QBCM,
respectively),
S.
spegazzinii
(two
plants
of
each
accession) and
S.
kurtzianum
(two plants of each accession)
with nested primers C2F–C3R. M stands for DNA size markers/
50
bp ladder
Table 3
Primers designed
for PCR amplification of
S
-
RNase
alleles
F
Forward,
R
Reverse,
D
Degenerate
Primer
Sequence (5 –3 )
0
0
Annealing
temp. (
_
C)
Based on
conserved
region
C1FD
(G/C)AACT(C/G/T)GT(A/C/T)TTA(A/C)
CATGGCC
55
C1
C2F
AACTTTACGATTCACGGTCTTTGG
60
C2
C3R
ACAGCAGGATCCATGCTT
60
C3
C4RD
GAGAGTT(G/C)TCA(A/G)AAGATCAAACCT
(A/C/T)TCTTT
55
C4
24
Euphytica (2012) 187:19–29
123

Kết quả (Việt) 1:

Amplification củaS-RNaseallele trong khoai tây hoang dãloàiLồng nhau PCR khảo nghiệm — với C1FD-C4RD chất nền, mồi trong cácVòng tròn của amplification và C2F-C4RD hoặc C2F-C3R lớp lót ở vòng thứ hai — được thực hiện đểkhuyếch đại và đặc trưngS-RNaseallele trongS.Chac-oenseQuần thể,năng suấtphân biệtĐẢNG CỘNG SẢN ROMANIAmảnh vỡ (hình 2b, c) có kích thước giống như những ngườibiếtS-RNaseallele (bảng 4). Do đó,S11-vàS16-RNaseallele mang lại C2-C4 amplicons của373và 367 bp, tương ứng (hình 2b) và C2-C3amplicons của 295 và 286 bp, tương ứng (hình 2c).Các mô hình khác nhau của amplified PCR mảnh vỡxác định giữa và trong vòngS.chacoenseacces-sions, cho thấy rằng những kết hợp cặp mồiđược phù hợp để chứng minhS-RNasebiến đổi genởS.chacoenseaccessions. Tuy nhiên, giống hệt nhauĐảng Cộng sản Romania sản phẩm mô hình đã được phát hiện cho kiểu gen củaPI458314 và QBCM accessions thực hiện khác nhauS-RNaseallele(S11-vàS16-RNasealleleởcây P3 và Q1, tương ứng (hình 2b, c). Điều này làgiải thích để có nghĩa là rằng khảo nghiệm PCR lồng nhau một mìnhkhông đủ để làm sáng tỏ cácS-RNasebiến đổi genmà vẫn còn khó hiểu.Để kiểm tra xem liệu việc sử dụng các chất nền, mồi lồng nhaucó thểđượcmở rộngđểkháchoang dãkhoai tâyloàibên cạnh đóS.chacoense, hai accessions củaS.spegazzi-niivàS.kurtzianumđược phân tích. Điều thú vị,lồng nhauchất nền, mồiamplifiedĐẢNG CỘNG SẢN ROMANIAsản phẩmởCácloài(Hình 2b,c)gợi ýmàkhôngchỉS-RNaseallele củaS.chacoense, S. spegazziniivàS.kurtzianumloài chia sẻ trình tự bảo tồnnhưng cũng đã các kích thước của mảnh amplifiedtương tự như. So sánh hiệu suất của cáckết hợp cặp mồi khác nhau trong tự nhiên bakhoai tây loài tiết lộ rằng C2F-C3R lồng nhausự kết hợp mồi là chịu trách nhiệm cho tốt nhấttổng thể amplification (hình 2c).Phân biệt đối xử củaS-RNase alen trong khoai tây hoang dãloài bởi SSCP phân tíchPhân tích SSCP tách các đảng Cộng sản Romania sản phẩm thu đượcvới C2F-C3R chất nền, mồi tạo ra khác nhau lồng nhaudải mẫu cho cácS-RNasegen (hình 3). ỞS. AB SPTPG PT O S Hình 1Phấn hoa-nhụy mối quan hệ phân tích bởi fluorecencekính hiển vi.mộtTương thích: tốc độ tăng trưởng bình thường của phấn hoa ống dọc theophong cách và trong số các noãn.bKhông tương thích: ức chếphấn hoa ống các tăng trưởng ở phần trên của phong cách. (Một sơ đồXemcủaCácnhụy hoaĐang hiển thịCácvùngquan sátởmỗibức ảnh được bao gồm.Onoãn,PGhạt phấn hoa,PTphấn hoaống,Sphong cách) 187:19 Euphytica (2012)-2923123 chacoense,hai mô hình khác nhau đã được xác địnhtrong PI458314 lên ngôi (hình 3, cây P1-P5),cho thấy sự tồn tại của một allele bên cạnh cácS11-RNaseallele. Khoai tây thực vật mang cácS16-RNaseallele (hình 3, trồng Q1) cho thấy một điều duy nhấtMô hình là khác nhau từ một trong những triển lãm của cácother plants of the accession. As expected, highlysignificantS-RNasegene variability was determinedwithin QBCM accession (Fig. 3, plants Q1–Q13) inaccordance with the elevated level of pollen–pistil MP1P3Q6Q9Q3Q1Q5K1K2K6K7O1O2O6O7 intron C4RDC3RC1FDC2F C1C2C3C4C5HV abcS. chacoenseS. spegazziniiS. kurtzianum 450 bp400 bp350 bp~ 405~ 370S11- allele373bp S16- allele367bp MP1P4P3P5P2Q6Q9Q3Q1Q5Q4K1K2K6 K7O1 O2 O6 O7350 bp300 bp S11- allele295bpS16- allele286bp S. chacoenseS. spegazziniiS. kurtzianum ~ 330~ 290 Fig. 2Solanum S-RNasegene.aDiagram showing locationsof conserved regions (C),hypervariable region (HV),and intron,and position of primers designed in this work (not to scale).bPCR amplification ofS.chacoense(two and five plants ofaccessions PI458314 and QBCM, respectively),S.spegazzinii(two plants of each accession) andS.kurtzianum(two plants ofeach accession) with nested primers C2F–C4RD. M stands forDNA size markers/50 bp ladder.cPCR amplification ofS.chacoense(five and six plants of accessions PI458314 andQBCM,respectively),S.spegazzinii(twoplantsofeachaccession) andS.kurtzianum(two plants of each accession)with nested primers C2F–C3R. M stands for DNA size markers/50bp ladder Table 3Primers designedfor PCR amplification ofS-RNaseallelesFForward,RReverse,DDegeneratePrimerSequence (5 –3 )00Annealingtemp. (_C)Based onconservedregionC1FD(G/C)AACT(C/G/T)GT(A/C/T)TTA(A/C)CATGGCC55C1C2FAACTTTACGATTCACGGTCTTTGG60C2C3RACAGCAGGATCCATGCTT60C3C4RDGAGAGTT(G/C)TCA(A/G)AAGATCAAACCT(A/C/T)TCTTT55C4 24Euphytica (2012) 187:19–29123

Kết quả (Việt) 2:

Ampli fi cation của
S
-
RNase
alen trong khoai tây hoang dã
loài
Nested PCR assay-với mồi C1FD-C4RD trong
vòng fi đầu tiên của ampli cation fi và C2F-C4RD hoặc C2F-
C3R mồi trong lần thứ hai tròn đã được thực hiện để
khuếch đại và đặc trưng
S
-
RNase
alen trong
S.
chac-
oense
quần thể,
năng suất
phân biệt
PCR
mảnh (Hình 2b, c.) có kích thước giống như những người
của tiếng
S
-
RNase
alen (Bảng 4). Như vậy,
S11-
và
S16
-
RNase
alen mang lại C2-C4 amplicon của
373
và 367 bp, tương ứng (Hình 2b.) Và C2-C3
amplicon của 295 và 286 bp, tương ứng (Hình 2c.).
Mô hình khác nhau của các mảnh PCR ampli fi ed đã được
xác định giữa và trong
S.
chacoense
acces-
những quyết, gợi ý rằng những kết hợp cặp mồi
là phù hợp để chứng minh
S
-
RNase
biến đổi gen
trong
S.
chacoense
đan có. Mặc dù, giống hệt
các mẫu sản phẩm PCR được phát hiện cho kiểu gen của
PI458314 và QBCM đan có mà thực khác nhau
S
-
RNase
alen (S11 - và S16 - RNase alen trong.. Cây P3 và Q1, tương ứng (Hình 2b, c) Điều này được giải thích là: rằng xét nghiệm PCR lồng nhau một mình là không đủ để làm sáng tỏ những S - RNase biến đổi gen. mà vẫn khó hiểu Để kiểm tra xem việc sử dụng các đoạn mồi lồng nhau có thể được mở rộng để khác hoang dã khoai loài ngoài S. chacoense, hai đan có của S. spegazzi- nii và S. kurtzianum được phân tích thú vị,. lồng mồi ampli fi ed PCR sản phẩm trong các loài (Hình 2b,. c) cho thấy rằng không chỉ có S - RNase alen của S. chacoense, S. spegazzinii và S. kurtzianum loài chia sẻ các trình tự bảo tồn mà còn các kích thước của các mảnh vỡ ed fi ampli của họ là tương tự. Việc so sánh hiệu suất của các tổ hợp cặp mồi khác nhau trong ba hoang dã loài khoai tây đã tiết lộ rằng C2F-C3R lồng kết hợp sơn lót chịu trách nhiệm cho tốt nhất tổng thể cation fi ampli (Fig. 2c). Phân biệt đối xử của S alen -RNase trong khoai tây hoang dã loài bởi SSCP phân tích phân tích SSCP tách các sản phẩm PCR thu được với các cặp mồi lồng nhau C2F-C3R tạo khác nhau mô hình dải cho S - RNase gen (Hình. 3). Trong S. ab S PT PG PT O S hình. 1 mối quan hệ thụ phấn nhụy hoa phân tích bởi uorecence fl kính hiển vi. Một Tương thích: bình thường tăng trưởng của ống phấn cùng phong cách và trong số các noãn. B không tương thích: ức chế sự tăng trưởng ống phấn ở phần trên của phong cách. (Một sơ đồ view của các nhụy hoa cho thấy các khu vực quan sát thấy trong mỗi bức ảnh được bao gồm. O noãn, PG hạt phấn hoa, PT phấn ống, S phong cách) Euphytica (2012) 187: 19-29 23 123 chacoense, hai mô hình khác nhau đã được xác định trong vòng PI458314 nhập (. Hình 3, thực vật P1-P5), cho thấy sự tồn tại của một allele ngoài S11 - RNase alen. Cây khoai tây mang S16 - RNase alen (. Hình 3, nhà máy Q1) cho thấy độc đáo mô hình đó là khác nhau từ một trong những biểu hiện bởi các nhà máy khác của việc gia nhập. Theo dự kiến, rất trọng yếu fi cant S - RNase biến đổi gen đã được xác định trong QBCM nhập (. Hình 3, trồng Q1-Q13) trong phù hợp với mức độ cao của phấn hoa, nhụy hoa M P1 P3 Q6 Q9 Q3 Q1 Q5 K1 K2 K6 K7 O1 O2 O6 O7 intron C4RD C3R C1FD C2F C1 C2 C3 C4 C5 HV một b c S. chacoense S. spegazzinii S. kurtzianum 450 bp 400 bp 350 bp ~ 405 ~ 370 S11- alen 373bp S16- alen 367bp M P1 P4 P3 P5 P2 Q6 Q9 Q3 Q1 Q5 Q4 K1 K2 K6 K7 O1 O2 O6 O7 350 bp 300 bp S11- alen 295bp S16- allele 286bp S. chacoense S. spegazzinii S. kurtzianum ~ 330 ~ 290 hình. 2 Solanum S - RNase. Gen một Sơ đồ hiển thị vị trí của vùng bảo tồn (C), khu vực hypervariable (HV), và intron,. Và vị trí của mồi được thiết kế trong công việc này (không quy mô) b PCR ampli fi cation của S. chacoense (hai và fi ve cây đan có PI458314 và QBCM, tương ứng), S. spegazzinii (hai nhà máy của mỗi gia nhập WTO) và S. kurtzianum (hai nhà máy của mỗi gia nhập WTO) với mồi lồng nhau C2F-C4RD. M là viết tắt của các dấu hiệu kích thước DNA / 50 bp thang. C PCR ampli fi cation của S. chacoense (fi ve và sáu nhà máy của đan có PI458314 và QBCM, tương ứng), S. spegazzinii (hai nhà máy của mỗi gia nhập WTO) và S. kurtzianum (hai nhà máy của mỗi gia nhập WTO) với mồi lồng nhau C2F-C3R. M là viết tắt của DNA marker size / 50 bp thang Bảng 3 mồi được thiết kế cho PCR ampli fi cation của S - RNase alen F Chuyển tiếp, R Reverse, D thoái hóa Primer Sequence (5 -3) 0 0 deo temp. (_ C) Dựa (2012) 187: 19-29 123