Extraction and Purificationof SNTI

Extraction and Purification
of SNTI The Soap Nut Trypsin Inhibitor was isolated and purified from soap nut seeds (Sapindus trifoliatus L.) according to the procedure adopted by Annapurna and Siva Prasad [42] and the results are shown in the Table- 2.

The extraction procedure was carried out maintaining physiological conditions and ice cold acetone was used to remove lipids. The endosperm was collected from the seeds after the removal of the hard seed coat and 25 g of the endosperm was homogenized with 200 ml of 0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.6 and then made up to 250 ml with the same buffer. The extract was then centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ºC and the supernatant (230 ml) was used in further steps.

Table 2. Summary of purification of soap nut seed protease inhibitor
The supernatant (230 ml) was treated with 50 % ice cold acetone (1:5 V) and the resultant mixture was centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ºC to remove lipids. The resultant defatted solution was subjected to ammonium sulphate precipitation.

To the supernatant (200 ml) from acetone fractionation, solid ammonium sulphate (62.6 g) was added gradually with constant stirring at 4 ºC to obtain 50 % saturation. The mixture was allowed to stand overnight at 4 ºC. The precipitate was collected by centrifugation at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ºC, then dissolved in 30 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.6 and dialyzed against the same buffer.

Proteins have numerous functional groups that can have both positive and negative charges. Ion exchange chromatography separates proteins with regards to their net charge. If a protein has a net positive charge at pH 7, then it will bind to a column of negatively charged beads, whereas a negatively charged protein would not. By changing the pH so that the net charge on the protein is negative, it too will be eluted.

The dialyzed sample (172 mg) was loaded on a CM-Cellulose column (2×80cm) previously equilibrated with 0.1M sodium phosphate buffer pH 7.6. After washing with 250 ml of the equilibration buffer, the following stepwise elution was performed with 200 ml each of 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M and 1.0 M NaCl in 0.1 M phosphate buffer pH 7.6. Fractions of 5 ml were collected at a flow rate of 60 ml per hour. These fractions were assayed for protein by measuring their absorbance at 280 nm as well as the inhibitory activity against trypsin using BAPNA as the substrate. The elution profile of CM-Cellulose chromatography for the inhibitor is shown in Fig. - 1. The fractions containing trypsin inhibitory activity (fractions 42-48) were pooled, dialyzed against distilled water at 4 ºC and lyophilized. The protein yield from ion exchange chromatography was 112 mg.

The sample from ion exchange chromatography (110 mg) was dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 7.6 and was loaded on Sephadex G-100 column (1.8 × 30 cm) which was previously equilibrated with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.6. The inhibitor was eluted with the same buffer. 2 ml fractions were collected at a flow rate of 12 ml per hour and the protein was monitored by measuring the absorbance at 280 nm. The trypsin inhibitory activity of the fractions was assayed using BAPNA as the substrate.

Kết quả (Việt) 2:

Khai thác và lọc
của SNTI The Soap Nut Trypsin ức chế đã được phân lập và tinh chế từ hạt nut xà phòng (Sapindus trifoliatus L.) theo thủ tục do Annapurna và Siva Prasad [42] và kết quả được hiển thị trong Bảng- 2. Việc khai thác thủ tục được thực hiện duy trì điều kiện sinh lý và băng acetone lạnh được sử dụng để loại bỏ các chất béo. Nội nhũ được thu thập từ những hạt giống sau khi loại bỏ vỏ hạt cứng và 25 g của nội nhũ đã được đồng nhất với 200 ml dung dịch 0,1M sodium phosphate buffer, pH 7.6 và sau đó thực hiện lên đến 250 ml với cùng một bộ đệm. Các chiết xuất sau đó được ly tâm ở 2500 rpm trong 15 phút ở 4 ºC và phần nổi (230 ml) đã được sử dụng trong các bước tiếp theo. Bảng 2. Tóm tắt lý sạch hạt xà phòng protease hạt giống chất ức chế sự gạn (230 ml) được điều trị bằng 50% băng acetone lạnh (1: 5 V) và hỗn hợp thu được được ly tâm ở 2500 rpm trong 15 phút ở 4 ºC để loại bỏ chất béo. Các giải pháp khử chất béo thu được được bị kết tủa ammonium sulphate. Để phù nổi (200 ml) từ acetone phân đoạn, rắn sunphat amoni (62,6 g) đã được bổ sung dần dần khuấy liên tục ở 4 ºC để có được 50% độ bão hòa. Hỗn hợp được phép đứng qua đêm ở 4 ºC. Kết tủa được thu thập bằng cách ly tâm 2500 rpm trong 15 phút ở 4 ºC, sau đó hòa tan trong 30 ml dung dịch 0,1 M sodium phosphate đệm pH 7,6 và thẩm tách với cùng một bộ đệm. Protein có nhiều nhóm chức năng có thể có chi phí cả tích cực và tiêu cực. Sắc ký trao đổi ion tách protein liên quan đến phí ròng của họ. Nếu một protein có một điện tích dương ở pH 7, sau đó nó sẽ liên kết với một cột của hạt mang điện tích âm, trong khi một protein mang điện tích âm sẽ không được. Bằng cách thay đổi độ pH tự mà phí ròng trên protein là tiêu cực, nó cũng sẽ được rửa giải. Các mẫu thẩm tách (172 mg) đã được nạp trên một cột CM-Cellulose (2 × 80cm) trước đây được cân bằng với 0,1M sodium phosphate pH đệm 7.6. Sau khi rửa với 250 ml của bộ đệm cân bằng, sự rửa giải theo từng bước sau đây được thực hiện với từng 0,1M, 0.2m, 0.3M, 0.4m và 1,0 M NaCl 200 ml trong 0,1 M phosphate đệm pH 7,6. Các phần phân đoạn của 5 ml được thu thập tại một tốc độ dòng chảy của 60 ml mỗi giờ. Những phần được kiểm định về protein bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 280 nm cũng như các hoạt động ức chế trypsin chống lại bằng cách sử dụng BAPNA như các chất nền. Hồ sơ cá nhân rửa giải của CM-Cellulose sắc ký cho các chất ức chế được hiển thị trong hình. - 1. Các đoạn có chứa hoạt tính ức chế trypsin (phân số 42-48) được gộp chung, thẩm tách khỏi nước chưng cất ở 4 ºC và đông khô. Sản lượng protein từ sắc ký trao đổi ion là 112 mg. Các mẫu từ trao đổi ion sắc ký (110 mg) được hòa tan trong 0,1 M phosphate đệm pH 7,6 và đã được nạp trên Sephadex G-100 cột (1,8 x 30 cm) mà trước đó đã được cân bằng với 0,1 M phosphate buffer, pH 7,6. Các chất ức chế đã được tách rửa với cùng một bộ đệm. 2 ml phân số được thu thập tại một tốc độ dòng chảy của 12 ml mỗi giờ và các protein được theo dõi bằng cách đo độ hấp thụ ở 280 nm. Các hoạt động ức chế trypsin của các phân số đã được khảo nghiệm sử dụng BAPNA như các chất nền.