For the construction of nuclear gen

For the construction of nuclear genomic libraries, nuclear-en-
riched DNA was isolated from 40 g of young fresh leaf tissue.
This was cut in small pieces, soaked for 2 rain in cold diethyl
ether, and ground with a Waring blender homogenizer (5 x 3 s,
low speed) in 100 ml of extraction buffer [0.4 M sucrose, 0.05 M
Tris-HC1 pH 8, 2mM CaC12, 0.03% ~ mercaptoethanol (v/v)l.
The resulting suspension was filtered through a 150-pm-mesh
nylon net, then through a 48 gm~mesh nylon net, and finally
centrifuged for 10min at 400g. The pellet was gently resus-
pended in 10 ml of buffer A (0.25 M sucrose, 0.05 M Tris-HClpH
8, 2 mM CaC12). The solution was carefully layered over 3 vol of a
sucrose buffer (2 M sucrose, 0.05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla)
contained in a soft Teflon tube. Ultracentrifugation was per-
formed in a swing rotor for 45 rain at 30,000 g. The resulting
pellet was dispersed in 10 ml of buffer A with a smooth brush, and
the suspension was centrifuged for 10rain at 1,600 g. All the
previous steps were performed at 4 ~ Nucleus enrichment was
checked by microscopic examination after DAPI (4',6-diami-
dino-2-phenyl-indole) staining. For nuclear lysis, the pellet
was resuspended in 10ml of buffer B (150raM NaCI, 10raM
EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) and incubated for
30 min at 65 ~ Nuclear debris was pelleted by centrifugation for
30 min at 4000 g. NaC1 was added to the supernatant to a final
concentration of 1.4M. A 1/10 vol of CTAB (mixed alkyl-
trimethylammonium bromide) solution (10% CTAB, 500mM
Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) was then added and the mixture
was incubated with gentle stirring for 10rain at 65 ~ One
volume of chloroform:isoamylalcohot (24:1) was added and,
after mixing, the solution was centrifuged for 5 min at 3,500 g at
20 ~ The supernatant was mixed with 2.5 vol of ethanol to
precipitate high-molecular-weight DNA which was then washed
in 76% ethanol-0.2 M NaOAc and resuspended in TE (10 mM
Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase digestion was per-
formed for 45min at 37~ A final standard phenol:chloro-
form:isoamylalcohol (25:24:1) extraction was carried out to
further purify the DNA. Nuclear DNA was digested with either
EcoRI or PstI and was then size-separated on a 10 40% sucrose
gradient (Sambrook et al. 1989). Two ligation reactions were
performed according to insert size range (0.7-2 kb, 2.5-5kb).
Fragments were ligated into pBluescript or pUC18 plasmids
(insert 3 : plasmid 1) following the manufacturer's instructions for
T4 DNA ligase (BRL). DH5~ bacterial cells were then trans-
formed with ligated plasmids (Chung and Miller 1988) and

Kết quả (Việt) 2:

Đối với việc xây dựng thư viện gen hạt nhân, hạt nhân-en-
DNA riched được phân lập từ 40 g mô lá tươi trẻ.
Điều này đã được cắt ra từng mảnh nhỏ, ngâm trong 2 mưa trong diethyl lạnh
ether, và mặt đất với một máy xay sinh tố đồng hóa Waring (5 x 3 s,
tốc độ thấp) trong 100 ml dung dịch đệm chiết [0,4 M sucrose, 0,05 M
Tris-HC1 pH 8, 2mm CaC12, 0,03% ~ mercaptoethanol (v / v) l.
Việc đình chỉ kết quả được lọc qua một 150-am -mesh
nylon net, sau đó thông qua một 48 gm ~ lưới nylon ròng, và cuối cùng là
ly tâm cho 10min tại 400g. Các viên đã nhẹ nhàng resus-
pended trong 10 ml dung dịch đệm A (0,25 M sucrose, 0,05 M Tris-HClpH
8, 2 mM CaC12). Giải pháp đã được lớp cẩn thận hơn 3 vol của một
bộ đệm sucrose (2 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla)
chứa trong một ống Teflon mềm. Siêu ly tâm được trọng
hình thành trong một cánh quạt xoay 45 mưa ở 30.000 g. Kết quả là
thức ăn viên được phân tán trong 10 ml dung dịch đệm A với một bàn chải mịn, và
hệ thống treo được ly tâm cho 10rain tại 1.600 g. Tất cả các
bước trước đó đã được thực hiện tại 4 ~ Nucleus làm giàu đã được
kiểm tra bằng kính hiển vi sau DAPI (4 ', 6-diami-
khủng long-2-phenyl-indol) nhuộm. Đối với ly giải hạt nhân, viên
đang lơ lửng trong 10ml đệm B (150raM Naci, 10raM
EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) và ủ trong
30 phút ở 65 ~ mảnh vỡ hạt nhân đã được ăn viên bằng cách ly tâm
30 phút ở 4000 g. NaC1 đã được thêm vào nổi đến một thức
nồng độ 1.4M. Một vol 1/10 CTAB (hỗn hợp alkyl-
trimethylamoni bromide), giải pháp (10% CTAB, 500mm
Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) sau đó được thêm vào và hỗn hợp này
được ủ với khuấy nhẹ nhàng cho 10rain 65 ~ Một
khối lượng chloroform: isoamylalcohot (24: 1) đã được bổ sung và,
sau khi trộn, các giải pháp được ly tâm trong 5 phút ở 3.500 g ở
20 ~ sự nổi được trộn với 2,5 vol ethanol để
kết tủa DNA trọng lượng phân tử cao sau đó được rửa sạch
trong 76% ethanol 0,2 M NaOAc và lơ lửng trong TE (10 mM
Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase tiêu hóa được trọng
hình thành cho 45min ở 37 ~ Một tiêu chuẩn phenol thức: chloro-
dạng: isoamylalcohol (25: 24: 1) khai thác được thực hiện để
làm sạch thêm DNA. DNA hạt nhân đã được tiêu hóa với một trong hai
EcoRI hoặc PstI và sau đó đã được kích thước phân cách trên đường sucrose 10 40%
gradient (Sambrook và cộng sự. 1989). Hai phản ứng thắt đã được
thực hiện theo chèn phạm vi kích thước (0,7-2 kb, 2.5-5kb).
Những mảnh vỡ được gắn vào pBluescript hoặc pUC18 plasmid
(chèn 3: plasmid 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho
T4 DNA ligase (BRL). Tế bào vi khuẩn DH5 ~ sau đó được xuyên
hình thành với plasmid ligated (Chung và Miller 1988) và