DNA extraction was performed accord

DNA extraction was performed according to published
methods with small modifications. Primers specific for the
H pylori urease A gene, 26-kd protein antigen,hpaA
gene, 0.86-kb DNA fragment and DNA sequences of 16S
ribosomal RNA17 were used as amplification targets as previously
described. For each locus, we selected 1 forward
primer as the common primer (FC) and 2 reverse primers (R1
and R2), with R2 located inside the amplifying region of R1.
Therefore, 2 DNA fragments, one internal to the other, are
expected to be amplified in each locus ❚Figure 1A❚.
The primers were combined into 2 groups: one group
consisted of all 5 FC primers with 5 R1 primers (FC-R1), and
the second group consisted of all 5 FC primers with 5 R2
primers (FC-R2). Thus, a total of 10 DNA fragments could be
amplified, in 2 tubes, each containing 5 amplicons.
The DNA extract was added to 20 µL of a reaction mixture
containing 10 mmol/L of tris(hydroxymethyl)aminomethane
hydrochloride (pH 8.3), 50 mmol/L of potassium chloride, 1.6
mmol/L of magnesium chloride, 0.001% (wt/vol) gelatin, 0.3
mmol/L of each deoxynucleotide, and 0.05 µmol/L of each
oligonucleotide primer mixture. Immolase DNA polymerase
(4.0 U; Bioline, London, England) was used. The PCR was
performed with a PCR thermal cycler (Mastercycler,
Eppendorf Scientific, Waterbury, NY), and the PCR conditions
were as follows: an initial denaturation of target DNA at
94°C for 5 minutes, followed by 32 to 41 cycles of 94°C for
30 seconds, 56°C for 50 seconds, and 72°C for 1 minute. The
final extension step was at 72°C for 10 minutes.
The PCR products were analyzed by electrophoresis of a
10-µL aliquot on a 2.0% agarose gel, stained with ethidium
bromide and visualized after excitation under UV light
❚Figure 1B❚. Because of the high diversity of DNA sequences
in H pylori, in this study, we defined a case as positive for H
pylori if 5 of 10 fragments or both DNA fragments from the same locus were amplified. Positive and negative (water
blank) control samples were assayed in each run.
The specificity of the PCR assay was evaluated by testing
with 3 H pylori strains obtained from American Type Culture
Collection (Manassas, VA): ATCC43504, ATCC700392
(26695), and ATCC700824 (J99), and 11 common bacterial
species—(1) Escherichia coli, (2) Enterobacter aerogenes, (3)
Enterobacter cloacae, (4) Enterococcus species, (5) viridians
group of Streptococcus, (6) Pseudomonas aeruginosa, (7)
Serratia species, (8) Klebsiella pneumoniae, (9) methicillinresistant
Staphylococcus aureus, (10) Lactobacillus species,
and (11) Citrobacter species, which were isolated from clinical
samples at Evanston Northwestern Healthcare, Evanston
Hospital—were selected as templates to assay. The PCR was
performed in the conditions described along with H pylori
J99, which was used as the positive control.

Kết quả (Việt) 1:

DNA khai thác được thực hiện theo công bốCác phương pháp với các sửa đổi nhỏ. Chất nền, mồi cụ thể cho cácH pylori urease một gen kháng nguyên protein 26-kd, hpaAgen, 0,86 kb DNA mảnh và trình tự ADN của 16ribosome RNA17 đã được sử dụng là khuếch đại mục tiêu như trước đâyMô tả. Đối với mỗi quỹ tích, chúng tôi chọn 1 phía trướcmồi là phổ biến mồi (FC) và 2 lớp lót ngược (R1và R2), với R2 nằm bên trong vùng amplifying R1.Do đó, 2 mảnh DNA, một trong những nội bộ khác, đềudự kiến sẽ được khuếch đại trong mỗi locus ❚Figure 1A❚.Các chất nền, mồi được kết hợp thành 2 Nhóm: Nhómbao gồm tất cả 5 FC chất nền, mồi với 5 R1 chất nền, mồi (FC-R1), vàNhóm thứ hai gồm có tất cả 5 FC chất nền, mồi với 5 R2lớp lót (FC-R2). Vì vậy, tổng cộng 10 DNA mảnh vỡ có thểkhuếch đại, trong 2 ống, có 5 amplicons.Trích DNA đã được thêm vào 20 ml hỗn hợp phản ứngcó chứa 10 mmol/L của tris (hydroxymethyl) aminomethaneHiđrôclorua (pH 8.3), 50 mmol/L kali clorua, 1.6mmol/L của clorua magiê, 0,001% (wt/vol) gelatin, 0,3mmol/L của deoxynucleotide mỗi và µmol/L 0,05, với vị trí của mỗi ngườioligonucleotide mồi hỗn hợp. Immolase ADN polymerase(4,0 U; Bioline, London, Anh) đã được sử dụng. Đảng Cộng sản Romaniathực hiện với một đảng Cộng sản Romania nhiệt người đạp xe máy (Mastercycler,Eppendorf khoa học, Waterbury, NY), và các điều kiện PCRnhư sau: một denaturation ban đầu của mục tiêu DNA tại94° C trong 5 phút, sau đó là chu kỳ 32 đến 41 94° c cho30 giây, 56° C trong 50 giây và 72° C trong 1 phút. Cácbước cuối cùng mở rộng là ở 72° C trong 10 phút.Các sản phẩm PCR được phân tích bởi electrophoresis của một10 ml aliquot trên một gel agarose 2,0%, màu với ethidiumbromua và hình dung sau khi kích thích dưới tia UV❚Figure 1B❚. Vì sự đa dạng cao của trình tự ADNtrong H pylori, trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định một trường hợp như là tích cực cho Hpylori nếu 5 10 mảnh hoặc cả hai DNA mảnh từ cùng một locus đã được khuếch đại. Tích cực và tiêu cực (nướcmẫu trống) điều khiển đã được assayed trong mỗi chạy.Các đặc trưng của các khảo nghiệm PCR được đánh giá bằng cách kiểm travới 3 H pylori chủng thu được từ các nền văn hóa kiểu MỹBộ sưu tập (Manassas, VA): ATCC43504, ATCC700392(26695), và ATCC700824 (J99), và 11 các vi khuẩn phổ biếnspecies—(1) Escherichia coli, (2) Enterobacter aerogenes, (3)Enterobacter cloacae, loài Enterococcus (4), viridians (5)Nhóm Streptococcus, (6) Pseudomonas aeruginosa, (7)Serratia loài, (8) Klebsiella pneumoniae, methicillinresistant (9)Staphylococcus aureus, loài Lactobacillus (10)và (11) loài Citrobacter được phân lập từ lâm sàngmẫu tại Chăm sóc sức khỏe Northwestern Evanston, EvanstonBệnh viện-đã được chọn làm mẫu để khảo nghiệm. Đảng Cộng sản Romaniathực hiện trong các điều kiện được mô tả cùng với H pyloriJ99, được sử dụng như kiểm soát tích cực.

Kết quả (Việt) 2:

Tách chiết DNA được thực hiện theo công bố
phương pháp với những thay đổi nhỏ. Cặp mồi đặc hiệu cho
pylori urease H Một gen, 26-kd kháng nguyên protein, hpaA
gen, đoạn DNA 0,86 kb và trình tự DNA của 16S
ribosome RNA17 đã được sử dụng như là mục tiêu khuếch đại như trước đây
mô tả. Đối với mỗi vị trí, chúng tôi chọn 1 mong
mồi là mồi chung (FC) và 2 mồi ngược (R1
và R2), với R2 nằm bên trong vùng khuếch đại của R1.
Do đó, 2 đoạn ADN, một nội các khác, được
dự kiến được khuếch đại trong mỗi locus ❚Figure 1A❚.
các mồi được kết hợp thành 2 nhóm: một nhóm
gồm tất cả 5 FC mồi với 5 mồi R1 (FC-R1), và
nhóm thứ hai gồm tất cả 5 FC mồi với 5 R2
mồi (FC-R2). Như vậy, tổng cộng 10 mảnh vỡ DNA có thể được
khuếch đại, trong 2 ống, mỗi ống 5 amplicon.
Các chiết xuất DNA đã được thêm vào 20 ml một hỗn hợp phản ứng
có chứa 10 mmol / L tris (hydroxymethyl) aminomethane
hydrochloride (pH 8.3), 50 mmol / L kali clorua, 1,6
mmol / L của magiê clorua, 0,001% (wt / vol) gelatin, 0,3
mmol / L của mỗi deoxynucleotide, và 0,05 mmol / L của mỗi
hỗn hợp oligonucleotide mồi. Immolase polymerase DNA
(4,0 U; Bioline, London, Anh) đã được sử dụng. PCR được
thực hiện với một chu trình nhiệt PCR (Mastercycler,
Eppendorf khoa học, Waterbury, NY), và các điều kiện PCR
như sau: một biến tính ban đầu của DNA mục tiêu ở
94 ° C trong 5 phút, sau 32-41 chu kỳ của 94 ° C trong
30 giây, 56 ° C trong 50 giây, và 72 ° C trong 1 phút. Các
bước mở rộng cuối cùng là ở 72 ° C trong 10 phút.
Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện của một
số chia hết 10 ml trên gel agarose 2,0%, nhuộm với ethidium
bromide và hình dung sau khi kích thích dưới ánh sáng UV
❚Figure 1B❚. Bởi sự đa dạng cao của các chuỗi DNA
trong H pylori, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định một trường hợp như tích cực cho H
pylori nếu 5 của 10 mảnh hoặc cả hai mảnh ADN từ cùng một locus được khuếch đại. (Nước tích cực và tiêu cực
trống) mẫu kiểm soát đã được kiểm định trong mỗi lần chạy.
Các tính đặc hiệu của xét nghiệm PCR được đánh giá bằng cách kiểm tra
với 3 chủng pylori H thu được từ Loại Văn hóa Mỹ
Collection (Manassas, VA): ATCC43504, ATCC700392
(26.695), và ATCC700824 (J99), và 11 vi khuẩn phổ biến
species- (1) Escherichia coli, (2) aerogenes Enterobacter, (3)
Enterobacter cloacae, (4) các loài Enterococcus, (5) viridians
nhóm Streptococcus, (6) Pseudomonas aeruginosa, ( 7)
loài Serratia, (8) Klebsiella pneumoniae, (9) methicillinresistant
Staphylococcus aureus, (10) loài Lactobacillus,
và (11) loài Citrobacter, được phân lập từ lâm sàng
mẫu tại Evanston Northwestern Healthcare, Evanston
Bệnh viện-được chọn làm mẫu để khảo nghiệm. PCR được
thực hiện trong các điều kiện được mô tả cùng với H pylori
J99, được sử dụng như kiểm soát tích cực.